杭州洵和生物科技有限公司
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一、实验流程
样本制备
石蜡切片：需经脱蜡（二甲苯梯度处理）和水化（梯度乙醇至水）。
冰冻切片：直接固定（4%多聚甲醛），避免长时间固定导致抗原遮蔽。
抗原修复
热修复：常用柠檬酸钠缓冲液（pH 6.0）或EDTA缓冲液（pH 9.0），微波或高压加热。
酶消化：胰蛋白酶或胃蛋白酶处理，适用于某些膜蛋白。
方法选择：
关键：根据抗体说明书选择修复条件，避免过度修复导致组织破坏。
阻断内源性过氧化物酶
3% H₂O₂室温孵育10-15分钟（HRP系统需此步骤）。
封闭
使用5% BSA或正常血清（与二抗同源）封闭30分钟，减少非特异性结合。
一抗孵育
稀释一抗于封闭液中，4℃过夜或室温1-2小时。需优化浓度（常用1:100-1:500）。
二抗孵育
HRP或荧光标记二抗，室温孵育30-60分钟。避免光照（荧光标记）。
显色
HRP系统：DAB显色（显微镜下控制时间，及时终止）。
荧光系统：直接封片观察，避光保存。
复染与封片
苏木素复染细胞核（1-2分钟），分化返蓝后脱水、透明、中性树胶封片。
显微镜观察
明场观察DAB显色（棕色）或荧光显微镜检测特定波长信号。
二、关键注意事项
对照设置
阳性对照：已知表达靶蛋白的组织。
阴性对照：不加一抗或同型IgG，排除非特异性染色。
常见问题解决
背景高：封闭不充分、一抗浓度过高、洗涤不彻底。增加封闭时间或降低抗体浓度。
信号弱：抗原修复失败、抗体失效、显色时间不足。检查修复条件及抗体活性。
脱片：烤片时间不足（石蜡切片需60℃烘1小时以上），或洗涤过猛。
试剂保存
抗体分装后-20℃保存，避免反复冻融。荧光二抗避光保存。
安全操作
DAB为致癌物，需在通风橱中操作并佩戴手套。
三、优化建议
抗体滴定：预实验确定最佳稀释度。
多色荧光IHC：选择光谱不重叠的荧光标记二抗，避免串色。
自动化平台：高通量实验可考虑自动化染色仪提高一致性。
通过系统优化实验条件和严谨操作，免疫组化可成为研究蛋白定位与表达的强有力工具。遇到问题时，建议从样本处理、抗体效价、试剂新鲜度等环节逐步排查。
