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提取小鼠成肌细胞原代培养的步骤如下：
1. 材料准备
试剂：PBS、胶原酶II、胰酶-EDTA、DMEM培养基、胎牛血清（FBS）、青霉素-链霉素溶液。
器械：手术剪、镊子、培养皿、离心管、细胞筛（70 μm）。
动物：选择适龄小鼠（通常为2-4周龄）。
2. 小鼠处理
安乐死：使用CO₂或其他方法安乐死小鼠。
消毒：用75%乙醇消毒小鼠四肢。
3. 肌肉组织分离
解剖：剪开皮肤，分离下肢肌肉（如股四头肌、腓肠肌）。
清洗：将肌肉组织放入预冷的PBS中，去除血液和结缔组织。
4. 组织消化
剪碎：将肌肉组织剪成1-2 mm³小块。
消化：加入0.2%胶原酶II，37°C消化30-60分钟，每隔10分钟轻轻摇动。
5. 细胞分离
终止消化：加入含10% FBS的DMEM培养基终止消化。
过滤：用70 μm细胞筛过滤，去除未消化组织。
离心：1000 rpm离心5分钟，弃上清。
6. 细胞重悬与接种
重悬：用含10% FBS和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基重悬细胞。
接种：将细胞悬液接种到培养皿中，放入37°C、5% CO₂培养箱。
7. 细胞培养
换液：24小时后首次换液，去除未贴壁细胞。
观察：每天观察细胞形态和生长状态。
8. 细胞传代
消化：细胞覆盖80%时，用胰酶-EDTA消化。
终止消化：加入含10% FBS的DMEM培养基终止消化。
离心：1000 rpm离心5分钟，弃上清。
重悬与接种：用新鲜培养基重悬，按适当密度接种到新培养皿。
9. 注意事项
无菌操作：全程无菌操作，防止污染。
细胞鉴定：通过标志物（如Desmin、MyoD）鉴定成肌细胞。
通过以上步骤，可以成功提取和培养小鼠成肌细胞原代。
