小鼠淋巴细胞的提取和分选的常见问题与解决方案

小鼠淋巴细胞的提取和分选是免疫学、肿瘤学和药物研发等领域的常见实验技术。以下是详细的实验步骤和注意事项：

一、小鼠淋巴细胞的提取

1. 实验材料准备

• 动物：健康小鼠（C57BL/6、BALB/c等品系，根据实验需求选择）。

• 试剂：

• 磷酸盐缓冲液（PBS，含1%胎牛血清或BSA以减少细胞黏附）。

• 淋巴细胞分离液（如Ficoll-Paque或Percoll，密度1.077-1.080 g/mL）。

• 红细胞裂解液（如ACK lysing buffer，适用于脾脏或胸腺样本）。

• 细胞培养液（RPMI 1640或DMEM，含10% FBS和1%双抗）。

• 肝素钠（抗凝剂，用于外周血采集）。

• 器械：无菌手术器械、细胞筛（70 μm）、离心管、注射器等。

2. 样本采集

• 外周血：

1. 眼眶采血或心脏穿刺收集血液至含肝素钠的管中。

2. 用PBS稀释血液（1:1比例），轻轻混匀。

• 脾脏/淋巴结/胸腺：

1. 安乐死后无菌取出组织，置于预冷PBS中。

2. 用注射器活塞或镊子在细胞筛上轻柔研磨，制备单细胞悬液。

3. 过筛后收集细胞悬液，离心（300 ×g，5分钟）弃上清。

3. 淋巴细胞分离

• 密度梯度离心法（适用于外周血或混合细胞悬液）：

1. 将稀释的血液或悬液缓慢叠加在淋巴细胞分离液上（比例约2:1）。

2. 离心（400 ×g，20分钟，室温，无刹车）。

3. 吸取白膜层（淋巴细胞富集层），用PBS洗涤2次（300 ×g，5分钟）。

• 红细胞裂解法（适用于脾脏等富含红细胞的器官）：

1. 加入2-3 mL ACK裂解液，冰上裂解1-2分钟（避免超时）。

2. 立即加入10 mL PBS终止反应，离心洗涤。

二、淋巴细胞的分选

1. 分选策略

根据实验目的选择标记物：

• T细胞：CD3⁺（总T细胞）、CD4⁺/CD8⁺（亚群）。

• B细胞：CD19⁺或B220⁺。

• NK细胞：NK1.1⁺（C57BL/6）或CD49b⁺（BALB/c）。

2. 分选方法

• 磁珠分选（MACS）：

1. 用抗小鼠CD3、CD4等抗体标记细胞（4℃，避光孵育20分钟）。

2. 加入磁珠偶联的二抗或直接使用偶联磁珠的一抗。

3. 过柱分离（LS或MS分选柱），阳性细胞被吸附，阴性细胞流穿。

4. 洗脱后获得目标细胞（纯度通常＞90%）。

• 流式细胞分选（FACS）：

1. 抗体标记（如CD3-FITC、CD4-APC等，需滴定优化浓度）。

2. 上机前用细胞筛过滤，避免堵塞喷嘴。

3. 设置门控策略（如FSC/SSC排除碎片，单细胞门排除聚集体）。

4. 分选后收集细胞至含培养液的管中（注意无菌条件）。

3. 注意事项

• 细胞活性：全程在冰上操作，使用预冷试剂，避免长时间处理。

• 抗体选择：注意抗体种属交叉反应（如抗大鼠CD4可能结合小鼠CD4）。

• 对照设置：分选时需设同型对照和未染色对照。

• 无菌环境：若后续需细胞培养，所有步骤需在超净台内完成。

三、常见问题与解决方案

1. 低细胞得率：

• 检查组织研磨是否充分，或密度梯度离心参数是否合适。

• 避免过度裂解红细胞（脾脏样本裂解时间≤2分钟）。

2. 分选纯度低：

• 优化抗体浓度或更换高特异性抗体。

• FACS分选前增加死细胞排除染料（如PI或DAPI）。

3. 细胞活性差：

• 分选后立即用含10% FBS的培养液重悬，避免长时间低温保存。

四、应用示例

• 免疫表型分析：分选CD4⁺T细胞后通过流式检测Th1/Th2细胞因子。

• 过继性转移：将分选的CD8⁺T细胞注入小鼠模型研究抗肿瘤效应。

通过以上步骤，可高效获得高纯度的小鼠淋巴细胞，满足下游实验需求。