RNA/DNA 提取方法取决于样本类型、目标核酸、下游应用、所需通量以及成本和时间的权衡。

RNA 和 DNA 提取是分子生物学中最基础也最关键的技术之一。它们的目的是从生物样本（如细胞、组织、血液、植物、细菌等）中分离出纯净且完整的核酸（RNA 或 DNA），以便进行下游分析，如 PCR、测序、基因克隆、基因表达分析等。

以下是关于 RNA 和 DNA 提取的要点总结：

一、核心目标

1. 裂解细胞/组织： 破坏细胞膜和核膜，释放核酸。

2. 去除杂质： 有效分离核酸与蛋白质、脂质、碳水化合物、盐类和其他细胞组分。

3. 保持核酸完整性： 尽量减少提取过程中核酸（尤其是脆弱的 RNA）的降解（酶解或化学/物理破坏）。

4. 浓缩： 将核酸溶解在适合下游应用的缓冲液（如 TE 缓冲液或 RNase-free 水）中，并达到所需浓度。

二、主要方法

1. 有机溶剂提取法 (酚-氯仿法)

• 原理： 利用酚和氯仿等有机溶剂变性蛋白质，使其与核酸分离。核酸（DNA 或 RNA）保留在水相中，变性蛋白质和脂质位于有机相或界面。异戊醇常加入氯仿中减少泡沫。

• DNA提取步骤： 裂解 -> 酚抽提 -> 氯仿抽提 -> 乙醇沉淀 -> 洗涤 -> 溶解。

• RNA提取步骤： 裂解 (通常含强变性剂如异硫氰酸胍/GITC) -> 酚/氯仿抽提 -> 异丙醇沉淀 -> 洗涤 (常用乙醇) -> 溶解 (RNase-free 水或缓冲液)。

• 优点： 成本相对较低，可获得高纯度核酸。

• 缺点： 操作繁琐耗时，使用有毒有机溶剂，RNA 提取中需严格防止 RNase 污染，DNA 提取中可能残留少量蛋白质。

2. 柱层析法 (硅胶膜/阴离子交换柱)

• 硅胶膜柱： 在高盐、低 pH 条件下，核酸磷酸骨架带负电荷，通过盐桥与带正电荷的硅胶膜结合；蛋白质等杂质不结合或结合力弱被洗掉；在低盐、高 pH 或水条件下，核酸从膜上洗脱下来。

• 阴离子交换柱： 利用核酸在特定条件下与带正电荷的基质结合，通过改变盐浓度或 pH 进行洗脱。

• 原理：

• 步骤 (硅胶膜柱为主流)： 裂解 -> 结合 (上样到柱上，核酸结合) -> 洗涤 (多次洗涤去除杂质) -> 洗脱 (用低盐缓冲液或水洗脱纯净核酸)。

• 优点： 操作快速、简便、高通量 (可配合真空或离心装置)，避免有毒有机溶剂，得到的核酸纯度高、质量稳定，便于自动化。

• 缺点： 成本相对较高 (需购买试剂盒)，对于某些复杂样本 (如植物、土壤) 可能结合效率低或杂质去除不彻底，洗脱体积相对固定。

• 应用： 这是目前实验室最主流的核酸提取方法，有大量成熟的商业化试剂盒。

3. 磁珠法

• 原理： 表面包被有特定官能团 (如硅羟基或寡核苷酸探针) 的磁珠，在特定缓冲条件下选择性地与核酸结合。在外加磁场作用下，磁珠（连同结合的核酸）被吸附到管壁，液体被移除；通过洗涤去除杂质后，更换缓冲液使核酸从磁珠上解离下来，磁场移除后即可回收核酸溶液。

• 步骤： 裂解 -> 结合 (加入磁珠混合) -> 磁分离+去上清 -> 洗涤 (重复磁分离和清洗) -> 洗脱 (加入洗脱液，混匀，磁分离后回收含核酸的上清)。

• 优点： 操作非常快速、简便、高通量 (尤其适合自动化液体处理工作站)，无需离心，易于实现样本追踪，灵活性高 (可轻松调整洗脱体积)。

• 缺点： 磁珠成本较高，需要磁力架或自动化设备。

• 应用： 在临床诊断、高通量测序样本制备等领域应用广泛，发展迅速。

三、关键考虑因素

1. 样本类型：

• 不同样本（血液、组织、细胞、植物、细菌、法医样本、FFPE 等）的细胞壁/膜结构、内源酶、干扰物质（如多糖、多酚）差异巨大，需要选择或优化相应的裂解方法和试剂配方。

2. 目标核酸：

• DNA： 相对稳定，主要需防止 DNase 降解。裂解液通常含 EDTA 螯合 Mg²⁺ (DNase 辅因子) 和 SDS 等去污剂。

• RNA： 极其脆弱，环境中 RNase 无处不在且非常稳定。RNA 提取是 重中之重：

• 使用 RNase-free 的耗材（枪头、离心管）和试剂（水、缓冲液）。

• 操作台、移液器、手套等需用 RNase 清除剂（如 DEPC 水处理或商品化去污剂）严格处理。

• 裂解液必须含 强变性剂（如异硫氰酸胍/GITC、β-巯基乙醇）迅速灭活 RNase。

• 操作速度要快，尽量在低温（冰上）进行。

• DNA vs RNA：

• 基因组 DNA (gDNA) vs 质粒 DNA (plasmid DNA)： 提取方法不同。质粒提取通常利用其小环状结构特性进行碱裂解和选择性沉淀/纯化。

• 总 RNA vs mRNA： 总 RNA 提取后，常需用 oligo(dT) 磁珠/柱子富集 polyA⁺ mRNA。

3. 下游应用：

• PCR/qPCR： 对纯度要求较高（无 PCR 抑制剂），对完整性要求相对宽松（尤其是短片段扩增）。

• 测序 (NGS)： 对核酸的纯度、完整性和总量要求都非常高。

• Southern/Northern Blot： 对核酸完整性要求极高。

• 克隆： 需要高纯度、高完整性的 DNA。

• 基因芯片： 需要高质量的总 RNA 或 mRNA。

4. 所需通量： 高通量应用（如大规模筛查、NGS 建库）优先选择基于柱法或磁珠法的自动化方案。

5. 成本和时间： 有机溶剂法成本最低但耗时；柱法和磁珠法试剂盒成本较高但省时省力。

四、结果评估

提取后的核酸通常需要进行质量和浓度检测：

1. 浓度和纯度：

• A260/A280： DNA ~1.8, RNA ~2.0 表示蛋白污染少。过低表示有蛋白污染。

• A260/A230： >1.8 (理想>2.0) 表示有机溶剂或盐类等污染少。过低表示有污染。

• 分光光度法 (Nanodrop等)： 快速测量浓度 (ng/µl) 和评估纯度 (A260/A280 和 A260/A230 比值)。

• 荧光法 (Qubit等)： 更准确测量浓度，特异性结合核酸，不受常见污染物影响，但需要染料和专用仪器。

2. 完整性：

• 琼脂糖凝胶电泳： 直观判断 DNA 片段大小或 RNA 的完整性 (真核总 RNA 应清晰看到 28S, 18S, 5S rRNA 条带，且 28S:18S ≈ 2:1)。DNA 应为单一的高分子量条带 (基因组 DNA) 或预期大小的条带 (质粒、PCR 产物)。出现拖尾或降解条带表明降解。

• 生物分析仪 (Bioanalyzer/Tapestation)： 自动化微流控芯片电泳，提供更精确的片段大小分布和完整性评分 (如 RIN for RNA, DIN for DNA)，是评估 NGS 样本质量的黄金标准，但仪器昂贵。

五、常见问题与对策

1. 产量低：

• 样本量不足或起始细胞数少。

• 裂解不充分：优化裂解条件（时间、温度、机械破碎）。

• 核酸未有效结合/沉淀：检查缓冲液成分（盐浓度、pH）、沉淀条件（温度、时间）、洗涤是否过度。

• 洗脱不充分：尝试预热洗脱液、增加洗脱时间或体积、重复洗脱。

• (RNA) RNase 污染导致降解。

2. 纯度差 (A260/A280 或 A260/A230 低)：

• 蛋白质污染 (A260/A280 低)：增加蛋白酶 K 消化时间/浓度，加强洗涤步骤。

• 有机溶剂/盐/碳水化合物污染 (A260/A230 低)：确保彻底去除有机相，增加洗涤次数（用 70-80% 乙醇），或尝试不同的洗涤液。对于植物样本，可能需要额外的多糖去除步骤。

3. 核酸降解：

• (RNA特别严重)： RNase 污染！严格确保 RNase-free 环境、耗材和试剂。操作迅速，使用冰盒。裂解后尽快进入变性环境或加入 RNase 抑制剂。

• 物理剪切 (尤其大片段DNA)： 避免剧烈涡旋或反复吹打核酸溶液，使用宽口枪头。

• 过度干燥： 乙醇沉淀后勿过度干燥沉淀。

• 反复冻融： 分装保存核酸，避免多次冻融。

4. DNA中有RNA污染 / RNA中有DNA污染：

• DNA 提取中可加入无 DNase 的 RNase A 消化 RNA。

• RNA 提取中，如需去除 gDNA 污染，可在提取过程中加入 DNase I 消化，或在提取完成后用 DNase I 处理 RNA 溶液，或在后续 RT 步骤中使用含 gDNA 去除酶的试剂盒。使用专门设计的“gDNA wipeout”缓冲液（在裂解液中）也是常用策略。

总结

选择哪种 RNA/DNA 提取方法取决于样本类型、目标核酸、下游应用、所需通量以及成本和时间的权衡。现代实验室中，基于硅胶膜柱和磁珠的商业化试剂盒因其便捷性、可靠性和高通量潜力已成为绝对主流。无论采用何种方法，对于 RNA 提取，严防 RNase 污染是成功的首要条件。提取后对核酸进行质量和浓度评估是确保下游实验成功的必要步骤。