细胞培养之细胞冻存方法和原理讲解

细胞冻存是细胞培养中的重要步骤，确保细胞长期保存并保持其活力和功能。以下是细胞冻存的原理、方法及注意事项的详细说明：

1. 细胞冻存原理

• 温度降低与代谢停止：随着温度降低，细胞内酶活性逐渐减弱，至-70°C时几乎停止，细胞代谢活动完全停止，实现长期保存。

• 冰晶形成与损伤：温度降低时，细胞内外的水分会结冰形成冰晶，导致细胞机械损伤甚至死亡。

• 冷冻保护剂的作用：加入甘油或二甲基亚砜（DMSO）等冷冻保护剂，可快速穿透细胞膜，降低冰点，延缓冻存过程，减少冰晶形成，保护细胞。

2. 冻存盒冻存原理

• 缓慢冻存的重要性：快速冷冻会导致冰晶损伤细胞，因此需缓慢冻存。

• 冻存盒的作用：冻存盒内含异丙醇，通过与冰箱环境的热交换，实现梯度降温，达到-1°C/min的降温效果，确保细胞缓慢冻存。

3. 为什么选择异丙醇

• 比热容大：异丙醇比热容大，需传递更多热量才能降温，因此降温速度慢，适合梯度降温。

• 热交换过程：冻存盒先与冰箱环境热交换，使盒身降温，再与异丙醇热交换，使异丙醇缓慢降温，从而实现细胞冻存管的均匀降温。

4. 手动梯度降温方法

• 4°C预冷：将冻存管在4°C放置20分钟，使细胞逐渐适应低温。

• -20°C过渡：将冻存管转移至-20°C放置30分钟至1小时，进一步降温。

• -80°C冷冻：将冻存管转移至-80°C过夜，确保细胞完全冻结。

• 液氮长期保存：最后将冻存管转移至液氮罐（-196°C）长期保存。

5. 细胞冻存步骤

• 细胞准备：选择对数生长期且状态良好的细胞。

• 冻存液配制：配制含10% DMSO和90%胎牛血清（FBS）的冻存液。

• 细胞收集：用胰酶消化并离心收集细胞。

• 重悬细胞：用冻存液重悬细胞，调整至适当密度（通常10^6 - 10^7 cells/mL）。

• 分装与标记：将细胞悬液分装至冻存管，每管1-2 mL，并清晰标记。

• 梯度降温：使用冻存盒或手动梯度降温方法，将冻存管逐步降温至-80°C。

• 液氮保存：将冻存管转移至液氮罐长期保存。

6. 注意事项

• 无菌操作：全程无菌操作，防止污染。

• 细胞密度：冻存时细胞密度不宜过低或过高。

• 冻存管质量：使用高质量的冻存管，防止冻存过程中破裂。

• 定期检查：定期检查液氮罐液位，及时补充液氮。

细胞培养之细胞冻存

原理:随着温度降低，细胞内的酶活性会逐渐降低，到-70°C左右，酶活性几乎为0，细胞的代谢活动完全停止，可以实现细胞的长期保存。但是，随着温度降低，细胞内外的水分会“结冰”并形成冰晶，冰晶会导致细胞内发生机械损伤等，从而引起细胞死亡。因此冻存细胞时需要加入冷冻保护剂甘油或二甲基亚砜(DMS0)。DMS0能快速穿透细胞膜进入细胞，降低冰点，延缓冻存过程，同时增加细胞膜的通透性，提高细胞内离子浓度，减少细胞内冰晶的形成，从而达到保护细胞的目的。

冻存盒冻存原理:细胞冻存过程为缓慢冻存。如果直接将细胞悬液放在超低温下快速冷冻，细胞会受到冰晶的机械损伤而死亡，因此选取加入了异丙醇的冻存盒进行梯度降温实现细胞的缓慢冻存。热量从冻存盒表面或微小间隙散发后先从异丙醇中通过对流和传导快速散发热量，再通过异丙醇把细胞冻存管中的热量向外传递，使每个冻存管以比较一致的速度逐渐降温，可以达到-1°c/min的降温效果。

为什么选择异丙醇:因为异丙醇的比热容比较大，冻存盒先与冰箱环境发生热交换，使得冻存盒身先降温，随后温度较低的冻存盒与盒内的异丙醇发生热交换，使异丙醇降温，但是异丙醇比热大，需要往外传递更多的热量才能降温，所以降温速度慢，可以实现梯度降温，

没有冻存盒，也可以手动实现梯度降温:将冻存管在4℃放置20min后转移到-20°℃放置30min后转移到-80°C过夜，最后将细胞转移到液氮中保存。注意转移过程中要保冷，避免产生温差或冻存管融化，