关于大鼠骨髓间充质干细胞（Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells, BMSCs）的分离及培养的详细实验流程及注意事项

一、实验材料准备

1. 实验动物：健康成年大鼠（通常选择6-8周龄，体重约150-200g）。

2. 主要试剂：

• 基础培养基：低糖DMEM或α-MEM（含1%双抗：青霉素-链霉素）。

• 补充物：10-15%胎牛血清（FBS，需提前灭活）。

• 红细胞裂解液（如ACK缓冲液）。

• PBS缓冲液（含2% FBS，用于冲洗）。

• 0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液。

• 细胞冻存液（含10% DMSO、40% FBS、50%培养基）。

3. 器械：

• 无菌手术器械（剪刀、镊子、止血钳）。

• 注射器（1ml、5ml）及针头（22G）。

• 细胞筛（70-100μm孔径）。

• 离心管（15ml、50ml）。

二、分离流程（无菌操作）

1. 骨髓提取

1. 处死大鼠：采用颈椎脱臼法或CO₂窒息法处死大鼠，75%乙醇浸泡5分钟消毒。

2. 取股骨和胫骨：

• 剪断后肢皮肤和肌肉，暴露股骨和胫骨。

• 剔除肌肉和结缔组织，用无菌纱布擦拭干净。

3. 冲出骨髓：

• 剪去骨两端，用注射器（含PBS+2% FBS）冲洗骨髓腔至离心管中。

• 反复冲洗至骨髓腔变白，收集骨髓悬液。

2. 单核细胞分离

1. 离心去碎片：骨髓悬液经70μm细胞筛过滤，1000rpm离心5分钟，弃上清。

2. 红细胞裂解：

• 加入5ml ACK裂解液，室温静置5分钟（避免超时损伤细胞）。

• 加入10ml PBS终止裂解，1000rpm离心5分钟，弃上清。

3. 重悬细胞：用含10% FBS的培养基重悬细胞，计数。

三、原代培养

1. 接种与贴壁：

• 将细胞悬液按1×10⁶ cells/cm²密度接种于培养瓶。

• 置于37℃、5% CO₂培养箱，24小时后首次换液（去除未贴壁细胞）。

2. 换液与观察：

• 每2-3天换液一次，去除死亡细胞碎片。

• 原代细胞约7-10天长至80%汇合，呈梭形或成纤维样。

四、传代培养

1. 消化：

• 弃旧培养基，PBS清洗1次。

• 加入0.25%胰酶-EDTA，37℃消化1-2分钟（镜下观察细胞变圆）。

• 加入含血清培养基终止消化。

2. 离心与传代：

• 1000rpm离心5分钟，弃上清，重悬后按1:2或1:3比例传代。

• 传代后细胞增殖加快，约3-4天可再次传代。

五、细胞鉴定

1. 形态学：贴壁生长，长梭形或成纤维样，漩涡状排列。

2. 表面标志物检测（流式细胞术）：

• 阳性标记：CD90（Thy-1）、CD29、CD44。

• 阴性标记：CD34、CD45、CD11b。

3. 多向分化能力验证：

• 成骨诱导：培养基+10mM β-甘油磷酸钠+50μg/ml抗坏血酸+100nM地塞米松，21天后茜素红染色（钙结节）。

• 成脂诱导：培养基+1μM地塞米松+0.5mM IBMX+10μg/ml胰岛素，14天后油红O染色（脂滴）。

六、注意事项

1. 无菌操作：骨髓提取易污染，需严格无菌环境。

2. 裂解时间控制：ACK裂解液作用不超过5分钟，避免损伤目标细胞。

3. 血清批次筛选：不同批次FBS可能影响细胞增殖，需预实验验证。

4. 传代时机：细胞汇合度达80%-90%时传代，避免过度生长导致分化。

5. 冻存与复苏：

• 冻存液需缓慢降温（程序降温盒或-80℃过夜后转液氮）。

• 复苏时快速融化，离心去除冻存液。

七、常见问题与解决

• 细胞贴壁差：可能因血清质量不佳或消化过度，优化胰酶浓度及消化时间。

• 污染：加强抗生素浓度（如双抗增至2%），严格无菌操作。

• 分化能力丧失：避免高代次细胞（建议使用P3-P5代细胞）。

八、应用方向

• 组织工程：用于骨、软骨修复。

• 疾病模型：共培养研究免疫调节或血管生成。

• 基因治疗载体：转染后用于靶向递送。