原代细胞常见组织的取材与分离技术-常见问题与解决方案

原代细胞（Primary cells）是指直接从活体组织或器官中分离获得的细胞，未经过永生化或基因改造，保留了体内原有的生物学特性，广泛应用于基础研究、药物筛选、疾病模型构建等领域。其取材和分离方法需根据组织类型、细胞特性及实验目的进行优化。以下是详细的操作流程和注意事项：

一、取材前的准备

1. 材料与试剂：

• 无菌器械（剪刀、镊子、手术刀等）。

• 预冷的PBS或生理盐水（含抗生素，如青霉素/链霉素）。

• 消化酶（如胰蛋白酶、胶原酶、透明质酸酶等）。

• 细胞培养基（根据细胞类型选择，如DMEM、RPMI 1640）。

• 胎牛血清（FBS，用于终止消化并提供营养）。

• 细胞筛（70μm、100μm滤网）。

• 离心管、培养皿、离心机等。

2. 样本来源：

• 动物组织（小鼠、大鼠、人等手术或解剖样本）。

• 临床样本（肿瘤组织、血液、骨髓等）。

• 注意：人类样本需遵循伦理规范，签署知情同意书。

二、常见组织的取材与分离方法

1. 实体组织（如肝脏、肺、肿瘤等）

步骤：

1. 取材：迅速取出组织，置于预冷PBS中清洗，去除血液和结缔组织。

2. 剪碎：用剪刀将组织剪成1–3 mm³小块。

3. 消化：

• 酶消化法：加入0.1–0.25%胰蛋白酶或胶原酶（Ⅰ/Ⅳ型），37℃消化15–30分钟（不同组织时间不同）。

• 机械法：对某些脆弱组织（如脑组织），可通过轻柔吹打或研磨分离。

4. 终止消化：加入含血清的培养基中和酶活性。

5. 过滤：用细胞筛过滤去除未消化的组织块。

6. 离心：1000 rpm离心5分钟，弃上清，重悬细胞。

7. 培养：接种于预涂基质（如胶原蛋白）的培养皿中。

关键点：

• 消化时间需优化，过长会导致细胞损伤。

• 肿瘤组织可能含坏死区域，需选择活性部分。

2. 血液（外周血单个核细胞，PBMCs）

步骤：

1. 抗凝处理：血液采集时使用EDTA或肝素抗凝管。

2. 密度梯度离心：

• 将血液缓慢叠加到Ficoll或Percoll分离液上。

• 离心（2000 rpm，20分钟），吸取中间白膜层（含PBMCs）。

3. 洗涤：用PBS离心洗涤2–3次。

4. 红细胞裂解（可选）：用ACK裂解液去除残留红细胞。

应用：分离淋巴细胞、单核细胞用于免疫学研究。

3. 上皮细胞（如皮肤、肠道）

特殊处理：

• 表皮细胞：可用dispase II酶消化分离表皮与真皮层。

• 肠上皮细胞：需EDTA联合胶原酶消化，或使用隐窝分离法。

4. 神经组织（如大脑、脊髓）

• 酶消化：常用木瓜蛋白酶或中性蛋白酶。

• 轻柔操作：避免神经元机械损伤。

三、原代细胞分离的常用技术

1. 酶消化法：

• 胰蛋白酶：适用于间质细胞，但对某些上皮细胞损伤较大。

• 胶原酶：对结缔组织（如肝脏、肿瘤）更温和。

• 混合酶：如胶原酶+透明质酸酶用于脂肪组织。

2. 机械分离法：

• 适用于对酶敏感的细胞（如某些干细胞）。

• 通过研磨、吹打或筛网过滤实现。

3. 差异贴壁法：

• 利用不同细胞贴壁速度差异纯化（如成纤维细胞贴壁快，可先去除）。

4. 免疫磁珠分选（MACS）或流式分选（FACS）：

• 通过表面标志物（如CD34、CD45）进一步纯化目标细胞。

四、注意事项

1. 无菌操作：全程在超净台中进行，避免污染。

2. 保持活性：

• 组织离体后尽快处理（通常<1小时）。

• 消化时控制温度和时间，避免过热或过度消化。

3. 细胞鉴定：

• 通过形态学（显微镜观察）、免疫荧光（标志物检测）或PCR验证纯度。

4. 培养基优化：

• 添加生长因子（如EGF、FGF用于上皮细胞）。

• 原代细胞通常需10–20% FBS。

五、常见问题与解决方案

六、应用示例

• 肝原代细胞：用于药物代谢毒性研究。

• 原代神经元：构建神经退行性疾病模型。

• 肿瘤原代细胞：个体化药物敏感性测试。

总结

原代细胞的分离需结合组织特性选择合适方法，并通过优化条件平衡细胞得率与活性。分离后的细胞需尽快用于实验（原代细胞传代次数有限）。对于难培养的细胞（如干细胞），可尝试3D培养或共培养系统提高存活率。