小鼠单核巨噬细胞培养条件有哪些？（细胞系 vs. 原代细胞培养条件及注意事项）

培养小鼠单核巨噬细胞（如RAW 264.7或原代细胞）需要特别注意其贴壁生长特性、对生长因子的依赖以及免疫活性维持。以下是具体培养条件和操作要点：

一、细胞系 vs. 原代细胞培养条件

1. 细胞系（如RAW 264.7）

• 培养基：

• 高糖DMEM（或RPMI-1640） + 10% FBS（优选热灭活，减少支原体风险） + 1% 双抗（青霉素-链霉素）。

• 注：RAW 264.7对血清质量敏感，建议使用优质胎牛血清（如Gibco）。

• 培养环境：

• 37℃、5% CO₂，湿度饱和的培养箱。

• 细胞贴壁生长，需定期传代（80%~90%密度时），避免过度密集导致分化或死亡。

• 传代方法：

• 弃旧培养基 → PBS轻柔冲洗 → 加入0.25%胰酶（含EDTA）消化1~2分钟（镜下观察细胞变圆） → 加入含血清培养基终止消化 → 离心（1000 rpm, 5 min）后重悬接种。

2. 原代小鼠单核巨噬细胞

（1）分离方法

• 来源：骨髓（Bone Marrow-Derived Macrophages, BMDM）或腹腔灌洗（Peritoneal Macrophages）。

• 骨髓来源（BMDM）步骤：

1. 处死小鼠，无菌取股骨/胫骨，用α-MEM冲洗骨髓。

2. 红细胞裂解（ACK缓冲液），离心后重悬于完全培养基。

3. 加入 M-CSF（20 ng/mL） 诱导分化（7天），每3天换液。

（2）培养条件

• 培养基：

• α-MEM/RPMI-1640 + 10% FBS + M-CSF（10~20 ng/mL）（维持巨噬细胞表型）。

• 注：激活极化可加LPS（100 ng/mL）+ IFN-γ（20 ng/mL）（M1型）或IL-4（20 ng/mL）（M2型）。

• 培养器皿：

• 原代细胞贴壁能力强，建议使用未经TC处理的培养皿（如细菌培养皿），或提前用多聚赖氨酸包被。

二、关键注意事项

1. 血清选择：

• 原代细胞对血清依赖性高，避免使用低端血清（可能导致分化异常）。

2. 细胞状态监控：

• 巨噬细胞活化后易分泌细胞因子，培养基可能较快变黄，需及时换液（每2~3天）。

• 原代细胞寿命有限（通常传代≤5次），建议冻存早期代次。

3. 污染防控：

• 巨噬细胞易吞噬细菌，若污染可能表现为空泡增多或突然脱落，需严格无菌操作。

4. 功能实验前处理：

• 实验前24小时换为无血清/低血清培养基，减少血清对吞噬、极化等实验的干扰。

三、常见问题解决

• 细胞不贴壁：检查培养皿是否过度TC处理，或血清活性不足（可换批号测试）。

• 分化异常：确认M-CSF浓度及活性（避免反复冻融）。

• 支原体污染：定期PCR检测，培养中可添加Plasmocin（2.5 μg/mL）预防。

四、师姐小贴士

• 冻存技巧：使用90% FBS + 10% DMSO，程序降温后液氮保存（原代细胞复苏存活率较低，建议高密度冻存）。

• 实验对照：极化实验需设置未刺激组（仅M-CSF），避免误判激活状态。