鸡卵泡颗粒细胞（granulosa cells）分离与培养的标准实验步骤

一、实验前准备

1. 材料与试剂

• 新鲜鸡卵巢（通常选用产蛋期母鸡）

• PBS缓冲液（含1%双抗：青霉素/链霉素）

• 胶原酶Ⅰ或Ⅱ（0.1-0.2%浓度，用DMEM/F12培养基配制）

• 胰蛋白酶-EDTA（0.25%）

• 终止培养基（DMEM/F12 + 10%胎牛血清FBS）

• 细胞培养皿/板、离心管、滤网（100μm、40μm）

• 细胞培养液：DMEM/F12 + 5-10% FBS + 1%双抗

2. 仪器

• 超净工作台、CO₂培养箱（37℃, 5% CO₂）、离心机、倒置显微镜

二、颗粒细胞分离步骤

1. 卵泡采集与清洗

• 处死母鸡后迅速取出卵巢，置于预冷PBS中。

• 选择直径2-5mm的黄色卵泡（富含颗粒细胞），用镊子剥离卵泡膜，挤出卵母细胞与颗粒细胞团。

• 将颗粒细胞团转移至PBS中漂洗2-3次，去除血细胞和卵母细胞残留。

2. 酶消化

• 将颗粒细胞团转移至15mL离心管，加入0.1%胶原酶（约1mL/卵泡），37℃水浴消化15-20分钟，每隔5分钟轻柔吹打一次。

• 加入等体积含FBS的培养基终止消化，离心（1000rpm, 5分钟）。

3. 细胞过滤与收集

• 上清弃去，沉淀用PBS重悬，依次通过100μm和40μm细胞筛，去除未消化的组织块。

• 滤液再次离心（1000rpm, 5分钟），沉淀用完全培养基重悬。

三、细胞培养

1. 接种与培养

• 调整细胞密度至1×10⁵~1×10⁶ cells/mL，接种于培养皿中（根据实验需求选择孔板规格）。

• 37℃、5% CO₂培养箱中培养，24小时后更换新鲜培养基以去除未贴壁细胞。

2. 换液与传代

• 每2-3天换液一次，观察细胞形态（贴壁后呈多边形或梭形）。

• 细胞融合度达80%时，用0.25%胰蛋白酶消化传代（消化时间控制在2-3分钟）。

四、注意事项

1. 无菌操作：全程在超净台内进行，避免污染。

2. 消化时间：过度消化会损伤细胞活性，需显微镜下观察消化程度。

3. 细胞鉴定：可通过免疫荧光检测FSHR（卵泡刺激素受体）或分泌雌激素能力验证细胞功能。

4. 原代限制：鸡颗粒细胞原代培养通常可维持3-5代，后续功能可能减退。

五、常见问题

• 低存活率：缩短消化时间或降低酶浓度。

• 污染风险：增加双抗浓度至2%，或使用两性霉素B（真菌污染时）。

如需进一步优化，可尝试添加生长因子（如IGF-1）或调整血清浓度。