上皮细胞的结构、功能、分离培养步骤及注意事项

一、上皮细胞的结构

基本特征

• 紧密连接（Tight Junctions）：封闭细胞间隙，维持屏障功能。

• 黏附连接（Adherens Junctions）：通过钙黏蛋白（E-cadherin）连接相邻细胞。

• 桥粒（Desmosomes）：提供机械强度，抵抗剪切力。

• 缝隙连接（Gap Junctions）：允许小分子和离子交换，传递信号。

• 极性：顶面（面向外界或腔体）与基底面（附着于基底膜），细胞器分布不对称。

细胞间连接：

• 基底膜：由层粘连蛋白（Laminin）和IV型胶原构成，通过整合素（Integrin）与细胞连接。

  形态分类

• 单层上皮（如小肠柱状上皮、血管内皮）。

• 复层上皮（如皮肤表皮、食管黏膜）。

  复层上皮（如呼吸道纤毛上皮）。

• 移行上皮（如膀胱上皮，可伸展）。

二、上皮细胞的功能

1. 保护：物理屏障（如皮肤表皮）和化学屏障（如黏液分泌）。

2. 分泌：腺体上皮分泌酶、激素或黏液（如胃腺、汗腺）。

3. 吸收：肠道上皮通过微绒毛吸收营养物质。

4. 感觉：特化上皮（如味蕾、嗅觉上皮）传递外界刺激。

5. 屏障与选择性通透：调节物质跨膜运输（如肾小管上皮）。

三、上皮细胞分离与培养步骤

（一）原代细胞分离

1. 样本获取：

• 来源：皮肤、肠道、呼吸道等组织。

• 处理：剪碎至1-2 mm³碎片，PBS清洗去除血液和杂质。

2. 酶消化法：

• 消化液：胶原酶IV（1-2 mg/mL）或胰蛋白酶-EDTA（0.25%）。

• 步骤：37℃孵育20-30分钟，间歇震荡，终止消化（含血清培养基）。

• 过滤：100 μm细胞筛过滤，离心收集细胞。

3. 纯化：

• 差异贴壁法：成纤维细胞贴壁快，通过换液去除。

• 磁珠分选：利用EpCAM或E-cadherin抗体标记上皮细胞。

（二）培养基配置

1. 基础培养基：

• DMEM/F12或角质形成细胞无血清培养基（Keratinocyte-SFM）。

2. 关键添加物：

• 生长因子：EGF（10-20 ng/mL）、bFGF（5-10 ng/mL）。

• 激素：氢化可的松（0.5 μg/mL）、胰岛素（5 μg/mL）。

• 钙离子：低钙（0.05-0.1 mM）维持未分化状态，高钙（1.2 mM）促进分化。

3. 基质包被：培养皿预铺胶原蛋白（Ⅰ/Ⅳ型）或Matrigel。

（三）培养条件

1. 环境：37℃、5% CO₂，湿度饱和。

2. 接种密度：高密度（70-80%汇合度）促进细胞间连接形成。

3. 换液频率：每2-3天更换新鲜培养基，避免代谢废物积累。

（四）传代

1. 消化：0.05%胰酶-EDTA室温消化3-5分钟，显微镜下观察细胞回缩。

2. 终止：加入含血清培养基中和胰酶。

3. 离心重悬：离心后重悬于新鲜培养基，按1:2-1:3比例传代。

四、注意事项

1. 无菌操作：

• 全程超净台操作，培养基添加抗生素（如青霉素-链霉素）。

2. 细胞去分化：

• 定期检测上皮标志物（角蛋白、E-cadherin）。

• 避免长时间传代（原代细胞传代不超过5代）。

3. 维持极性：

• 使用Transwell小室培养，模拟顶-基底极性。

• 气-液界面培养（如皮肤模型）。

4. 传代优化：

• 消化时间精确控制，避免过度损伤。

• 添加ROCK抑制剂（Y-27632，10 μM）减少悬浮期细胞凋亡。

5. 污染风险：

• 支原体检测（如Hoechst染色），定期冻存备份。

6. 3D培养：

• Matrigel或胶原支架中培养类器官，模拟体内微环境。

五、常见问题与解决

• 细胞贴壁差：检查基质包被是否均匀，增加钙离子浓度。

• 污染：丢弃污染样本，加强实验台消毒。

• 生长缓慢：补充新鲜生长因子或更换培养基批次。

六、应用示例

• 肠道上皮（Caco-2）：药物渗透性研究。

• 肺上皮（A549）：空气污染物毒性测试。

• 人工皮肤（HaCaT）：烧伤修复与化妆品测试。

一、形态学特征

1. 基本结构

• 极性：具有顶面（面向腔体或外界）和基底面（附着于基底膜），细胞器分布不对称。

• 细胞间连接：通过紧密连接（zonula occludens）、黏附连接（adherens junction）、桥粒（desmosomes）和缝隙连接（gap junction）维持结构完整性和信号传递。

• 基底膜依赖：通过整合素（integrin）与基底膜中的层粘连蛋白（laminin）和IV型胶原结合。

2. 分类与形态

• 单层上皮：如血管内皮（扁平）、小肠吸收细胞（柱状）、甲状腺滤泡上皮（立方）。

• 复层上皮：如皮肤表皮（角化复层鳞状上皮）、食管（未角化）。

• 假复层上皮：如呼吸道纤毛上皮（所有细胞接触基底膜，但核位置不一）。

• 特殊类型：移行上皮（膀胱，细胞层数随拉伸变化）。

二、培养技术

1. 原代细胞分离与纯化

• 样本来源：皮肤、消化道、呼吸道、乳腺等组织。

• 酶消化法：常用胶原酶（collagenase IV）或胰蛋白酶（trypsin-EDTA）消化基底膜，释放细胞。

• 差异贴壁法：利用成纤维细胞贴壁快的特点，通过换液去除杂质。

• 磁珠分选：基于上皮细胞标志物（如EpCAM、E-cadherin）进行免疫磁珠分选。

2. 培养基与条件

• 生长因子：EGF（表皮生长因子）、FGF（成纤维细胞生长因子）。

• 激素：氢化可的松、胰岛素。

• 钙离子：低钙（0.05-0.1 mM）抑制分化，高钙（1.2 mM）促进连接形成。

• 基础培养基：DMEM/F12或Keratinocyte-SFM（无血清配方）。

• 关键添加物：

• 基质包被：胶原蛋白（Ⅰ型或Ⅳ型）、层粘连蛋白或Matrigel模拟基底膜环境。

3. 培养条件优化

• 气体环境：5% CO₂，37°C恒温。

• 细胞密度：高密度接种（>70%汇合度）有利于细胞间连接形成。

• 传代方法：使用低浓度胰酶（0.05% trypsin-EDTA）短暂消化，避免过度损伤连接蛋白。

4. 特殊培养技术

• 3D培养：Matrigel或胶原支架中形成类器官（organoids），模拟体内结构。

• 气-液界面培养：用于皮肤或呼吸道上皮，促进分层和角化。

• 共培养系统：与成纤维细胞或免疫细胞共培养，研究微环境相互作用。

三、常见挑战与解决方案

1. 污染风险：严格无菌操作，添加抗生素（如青霉素-链霉素）。

2. 细胞去分化：定期检测标志物（如角蛋白CK5/6、E-cadherin）。

3. 极性丧失：使用Transwell小室培养，模拟顶-基底极性。

4. 传代困难：优化消化时间，添加ROCK抑制剂（Y-27632）减少凋亡。

四、应用领域

1. 疾病模型：构建癌变上皮（如HeLa、MCF-7细胞系）研究肿瘤转移。

2. 药物筛选：肠道上皮（Caco-2）用于药物渗透性测试。

3. 组织工程：人工皮肤（如EpiDerm™）用于烧伤修复。

4. 屏障功能研究：肺上皮（A549）评估空气污染物毒性。

五、参考文献与工具

• 经典细胞系：MDCK（犬肾上皮）、HaCaT（人永生化表皮细胞）。

• 关键试剂：Matrigel（Corning）、Defined Keratinocyte-SFM（Gibco）。

• 检测方法：免疫荧光（ZO-1染色）、跨上皮电阻（TEER）测量屏障完整性。

• 本期将为您介绍上皮细胞的结构、功能、分离培养步骤及注意事项，帮助您快速了解上皮细胞，顺利展开相关实验，预祝早日发文。