细胞培养工作中怎样预防支原体的污染？

当细胞（特别是传代细胞）被支原体污染后，细胞内的DNA、RNA及蛋白表达发生改变，而细胞的生长率一般并未发生显著的影响，因而细胞被支原体污染一般难以察觉。同时支原体可透过一般过滤膜（0.22-0.45μm），对于生物制药领域而言，小试中我们几乎不会使用0.1μm的除病毒过滤膜来过滤培养基（生产中通常都会进行除病毒来保证原液质量），那么小试结果在支原体污染的情况下就显得不那么可靠了，尤其是科研工作者往往不会在第一时间怀疑自己的培养物受到了支原体的污染.

细胞培养工作中，主要从以下几个方面来预防支原体的污染：

1）控制环境污染

2）严格实验操作

3）细胞培养基和器材要保证无菌

4）在细胞培养基中加入适量的抗生素

　　支原体污染细胞后，常用清除支原体方法有：

对于非重要的细胞，如培养中的细胞、WCB的细胞等，将培养物与用过的培养基灭活后丢弃即可。对于较为重要的细胞，如来源珍贵或实验室中细胞保藏量较小等可以采用以下（2）-（8）的方法。

1）用MRA处理：用支原体清除剂（Mycoplasma Removal Agent）处理细胞，作用浓度为 25μg/ml，两周可以清除支原体。

2）用清洗纯化法清除支原体污染的方法：细胞营养驯化→优质细胞群的筛选→细胞清洗→反复离心洗涤，其原理是利用离心力、细胞、微生物质量和悬液的浮力差达到清除支原体的目的。由于支原体个体小且除发酵支原体外多为细胞外寄生,所以通过反复洗涤细胞和低速离心换液使其中潜在的支原体数量降低至极限. 如结合敏感抗生素的抑杀作用，可达到更好的效果。

3）药物辅助加温处理：先用药物处理后，再将污染的组织培养物放在41℃培养18小时，可杀死支原体，但对细胞有不良影响。

4）使用支原体特异性血清：用5%的兔支原体免疫血清可去除支原体污染，因特异抗体可抑制支原体生长，故经抗血清处理后11天即转为阴性，并且5个月后仍为阴性。

5）动物体内接种除菌法：把受支原体污染的肿瘤细胞接种在同种动物皮下或腹腔中，借动物免疫系统消灭支原体，而肿瘤细胞却能在体内继续生长，待一定时间后，从体内取出细胞再进行培养繁殖。

6）巨噬细胞吞噬法：从动物腹腔采取巨噬细胞，为排除其它细胞成分，可先进行纯化，然后再加入被支原体污染的细胞培养液中混合培养。在培养过程中，为检查支原体是否已被消除干净，可利用支持物培养法验证，取出支持物逐日染色、镜检观察，至支原体已被消除干净为止。

7）使用支原体清除培养基，每2~3天更换1次新鲜培养液，换液时用无菌的平衡盐溶液洗涤细胞1~2次；期间如果细胞密度过大，请保持细胞密度适当（贴壁细胞可能需要用胰酶消化），并更换新的培养器皿，3天之后，即可见明显清除效果；处理15天后，可以用支原体检测试剂盒进行检测，检测支原体是否杀灭完全；如果仍有支原体残留，可以考虑再处理6天；为避免细胞再次受到“支原体”的污染，以后每隔1个月进行支原体的常规检测，以保证没有新的支原体污染。

注：支原体污染时细胞表现为长得不好，也不死亡，同时，培养基又是清亮的，时间长达一周也没有什么变化，这时基本上可以判断出是支原体污染了。

支原体污染带来的影响

（1）细胞外形可以没有明显的变化，支原体可以与细胞共存，污染后细胞液不会死亡，培养基一般不发生浑浊；

（2）使用被支原体污染的细胞做实验会严重影响实验的结果，因为支原体会抑制细胞生长；导致染色体畸变；细胞膜抗原性改变；细胞复苏后存活率降低等。

（3）影响细胞的代谢和功能：培液中的精氨酸被支原体大量消耗，引起细胞蛋白质、DNA、rRNA、mRNA的合成障碍；支原体活动使培液成分发生改变（如发酵型支原体降解糖类产生酸性物质），影响细胞代谢。

（4）培养过程中细胞破碎较多，培养基pH变化明显，需要频繁更换新鲜培养基；

（5）细胞被支原体污染后会形成共生体系导致污染不断扩大。

应对支原体污染的策略

细胞一旦发生了支原体污染, 应当弃之。虽然已有了针对支原体的抗生素及最近出现的所谓支原体清除剂, 这些方法只能杀灭细胞外的支原体。有一部分支原体可侵入到细胞内部。我们用扫描电子显微镜观察支原体污染细胞时, 也在细胞内看到了支原体。细胞内的支原体可逃避支原体清除处理。这些细胞内的支原体颗粒可再度离开细胞, 去污染更多的细胞。所以对支原体污染细胞中清除支原体的工作,实际上是非常困难的, 几乎不可能彻底清除支原体。除非是不可替代或无法重新获得的细胞, 一般没有必要进行支原体清除工作。

在科学研究和开发研究中, 避免支原体污染及减少支原体污染对科研、开发工作影响的最好方法就是定期对培养的细胞进行支原体检测。这种常规支原体检测可最大限度降低支原体污染, 确保排除未知支原体与细胞相互作用而产生的严重后果。尤其是在研究领域, 常忽视培养细胞中支原体的污染, 或对支原体污染程度估计不足。迫切需要提高认识, 加强对培养细胞支原体污染的检测。