培养的细胞总是被污染,有必要挽救吗？

   细胞培养过程中，污染是一个常见且令人头疼的问题。细胞污染不仅会影响实验结果的准确性，还可能导致实验的彻底失败。本文将讨论细胞污染的原因、影响以及预防和清除细胞污染的方法。

   在任何情况下，完全去除细胞中的微生物污染是非常困难的！因为不管是哪一种操作，对细胞的生长而言都是一种额外刺激，很有可能导致细胞状态改变甚至死亡；而过度使用抗生素可能产生更强抗性的菌株，撤药后极易复发。对于细胞污染，建议立即抛弃，不要再想挽救。然后彻底消毒灭菌培养间，CO2孵箱，器皿和培养液。

为了减少损失，提前做好防止细胞污染的措施至关重要：

1. 严格的无菌操作

无菌操作是防止微生物污染的关键。实验人员在进行细胞培养操作时，应严格遵守无菌操作规范：

•手部消毒：操作前、操作过程中应频繁使用消毒液清洗双手。

•使用无菌耗材：培养皿、移液器吸头、试管等耗材应保证无菌。

•定期清洁工作台：使用75%乙醇或其他适宜的消毒液擦拭工作台面，保持工作环境的清洁。

•无菌工作台：在无菌工作台（如生物安全柜）中进行所有细胞操作，定期对工作台进行清洁和消毒。

2. 培养基和试剂的质量控制

•使用高质量的培养基和试剂：选购经过严格质量控制的培养基和试剂，避免使用来源不明或储存时间过长的试剂。并且需要对血清进行常规污染检测，以及建立良好的分装习惯和体系。

•培养基的无菌过滤：制备培养基时应进行无菌过滤，去除可能存在的微生物。(购买的商业化培养基通常已过滤)

•分装管理：培养基和试剂应尽量小批量分装，避免重复开封导致的污染。所有分装使用或备用的试剂（如血清、胰酶）都应记录批次号。

3. 细胞处理

• 细胞分离：不同细胞株应在不同的培养皿或培养瓶中培养，避免交叉污染。

• 冷冻和复苏：细胞冷冻和复苏过程中要严格遵守操作规程，确保细胞存储和处理过程中的无菌性。

4. 良好的实验室管理

•定期监测实验室环境：通过定期的环境监测，及时发现并处理潜在的污染源。

•独立的实验区：将细胞培养区与其他实验区分开，避免交叉污染。

•分开存放细胞株：不同细胞株应尽量分开培养和储存，避免交叉污染。

5. 设备的定期维护

•培养箱的定期清洁和消毒：定期对培养箱进行清洁和消毒，防止微生物滋生。

•显微镜和移液器的清洁：实验结束后，应及时清洁和消毒显微镜、移液器等设备，避免残留物积累。

6. 定期检测

• 细菌和真菌检测：定期对培养基和细胞进行细菌和真菌污染检测，及时发现并处理污染。

• 支原体检测：采用PCR、ELISA等方法定期检测支原体污染，确保细胞培养环境的纯净。

• 交叉污染检测：通过STR（短串联重复序列）分析等分子生物学技术，定期验证细胞株的纯度，防止交叉污染。

7. 分离和储存管理

• 细胞株的独立培养：不同细胞株应在不同的培养皿或培养瓶中培养，避免交叉污染。

• 单独储存：将不同细胞株分别储存在不同的冷冻管中，并在保存前标明细胞株信息，避免混淆。

• 定期更换培养基：定期更换培养基，防止因长期使用导致的营养耗尽和污染积累。

8. 培训和规范操作

1、 使用抗生素：对细胞培养基使用双抗（在细胞培养基中推荐青霉素的工作浓度为100U/ml，链霉素为0.1mg/ml。）

2、 支原体预防：可以使用支原体预防试剂预防支原体的污染产生。

3、培养器材、用品需消毒灭菌：细胞培养所用器材要清洗消毒，各种溶液灭菌处理。

4、实验操作者的无菌意识

①洗手消毒，穿隔离衣。工作开始时要用酒精棉球擦手并对器皿进行酒精擦拭；

②操作需在生物安全柜内并佩戴口罩；

③尽量使用一次性无菌器材操作，对于多次使用的需实高压灭菌处理。实验完毕用酒精擦拭操作台面。

5、细胞交叉污染的预防

①一次对多种细胞培养操作时，所用器具要严格区分；

②在进行换液或传代操作时尽量避免液体溅出污染其他细胞；

③新购细胞应及时留种冻存，如遇污染可重新复苏。

6、无菌室或细胞房的污染预防

①使用0.1%新洁尔灭对细胞房或无菌室进行全面彻底擦洗;

②使用紫外灯长时间（0.5-2h）照射；

③使用甲醛熏蒸法。