细胞实验 | 细胞活性与增殖的检测方法（细胞增殖及细胞活力检测）

    细胞增殖是生命体的重要生命特征，是生物体生长、发育、繁殖和遗传的基础，细胞增殖能力是反应细胞活性的重要指标。细胞增殖最直观的表现是细胞分裂，即由原来的一个亲代细胞变为两个子代细胞，从而使细胞数量增加。各种细胞在分裂之前，都需要经过一定的物质准备。物质准备和细胞分裂是一个高度受控的相互连续的过程。这一相互连续的过程即为细胞增殖。

    对细胞活性与增殖的检测可以直观的反应细胞生长状态，以及相关化合物或外界刺激所产生的细胞毒性，是评估细胞活性、基因毒性和药物活性的基本方法，被广泛应用于分子生物学、肿瘤生物学、药代动力学等多研究领域，可以直观评判特定试剂诱导细胞凋亡、坏死、焦亡的具体效果，在药物研发早期的化合物筛选以及后期的安全性评估中都发挥了重要作用，可以说是生命科学相关研究中基础的研究手段之一  。

   目前细胞增殖/毒性/活力检测方法按照原理通常可以分为以下几类：细胞计数法、比色法（CCK-8 法、MTT 法、LDH 检测等）、细胞荧光标记检测、DNA 合成测定（BrdU 法或 EdU 法）、ATP 含量检测（Cell-Titer Lumi™）、代谢活性检测、细胞膜通透性测定（台盼蓝、中性红）等。那每一类又具体包括了哪些方法呢？下面我们将一一为您详细介绍。

细胞计数
细胞计数是检测细胞活性的基础方法之一，利用计数板或计数仪得出细胞数目，操作简单，可用于绘制细胞生长曲线，但是却无法区分增殖细胞和非增殖细胞，且手工计数耗时较久，因此并不适合样品量多的情况。

MTT、WST-1、CCK-8
这三种检测方法原理基本相同，都是利用细胞线粒体内的一些脱氢酶将检测试剂还原为有色产物，随后利用酶标仪测量相应 OD 值，在一定范围内，OD 值与活细胞数目成正比，从而反应细胞活性情况。

MTT 是一种四唑盐，其所生成的还原产物不溶于水，并且对细胞毒性较大，因此在一定程度上限制了其应用。目前常用的 CCK-8 试剂盒所选用的检测试剂为 WST-8，它是 MTT 的一种升级替代产品，与 MTT 或其它 MTT 类似产品相比，WST-8 检测灵敏度更高、更易溶解、并且更加稳定。因此相关试剂盒产品具有背景吸光度低、线性范围宽、检测灵敏度高；操作简单，免去细胞洗涤步骤；细胞毒性小，针对不同样品可多次测定选取最佳测定时间等优点。WST-1 和 WST-8 相似，但通常不能制作成一步法的试剂盒。

细胞荧光标记检测

 原理概要：利用无毒性作用的荧光标记物对细胞膜、细胞质等细胞特定结构进行标记，然后通过对增殖细胞群体荧光强度的测定反映细胞的增殖情况。

 （1）CFSE染色法

优点：持续时间长，稳定性强，具有良好的示踪作用，可以追踪细胞在体内的分裂增殖过程，并且对细胞生理活动没有任何影响。

缺点：①浓度太低，细胞标记的荧光强度不够，太高了对细胞有毒性，且影响细胞增殖；②标记孵育时要经常摇匀。

应用场景：用于检测细胞增殖，细胞周期的估算及细胞分裂等方面。 

（2）PKH26染色法

优点：持久的荧光信号、高亮度和稳定性、不影响细胞生理功能、高灵敏度和特异性、快速高效。

缺点：暂无

应用场景：细胞增殖分析、细胞迁移分化跟踪和细胞间相互作用。

DNA 合成测定（BrdU 法或 EdU 法）

直接检测细胞中 DNA 合成情况被认为是最精准的检测细胞增殖方法之一。起初广泛使用的方法是放射性标记核苷掺入法，如如氚标记胸腺嘧啶脱氧核苷 ([3 H]thymidine) 掺入法。但是该方法具有放射性污染，并且很难实现单细胞检测，因此使用受到很大限制。目前较为常用的检测方法为 BrdU 法或 EdU 法，后者中的关键步骤使用了今年获得诺贝尔奖的点击化学技术。

BrdU，即 5-溴脱氧尿嘧啶核苷，是一种胸腺嘧啶的衍生物，可以代替正常的胸腺嘧啶参与细胞 DNA 复制过程，随后利用 BrdU 特异性抗体检测 BrdU 的掺入情况，从而检测 DNA 合成情况。BrdU 法中为了使大分子的 BrdU 特异性抗体进入细胞并且与 DNA 上的 BrdU 结合，需要对双链 DNA 进行变性处理（例如酸变性、热变性或 DNase 消化等），这种变性可能会影响细胞形态，影响后续的免疫荧光和免疫组化检测、DNA 荧光染色等。

EdU，中文名为 5-乙. 炔基-2』-脱氧鸟苷，是一种新型胸腺嘧啶脱氧核苷类似物，同样可以在 DNA 合成过程中替代胸苷掺入到新合成的 DNA 中。并且 EdU 上额外添加的乙. 炔基能够与荧光标记的小分子叠氮化物探针通过「点击反应」形成稳定的三唑环，从而标记新合成的 DNA 分子。与 BrdU 法相比，EdU 法无需 DNA 变性，只需简单的固定通透就能够使小分子探针进入细胞，标记 DNA 分子，检测到单个细胞的增殖情况。

原理概要：通过测定细胞的DNA合成含量来评价细胞的增殖能力，是目前实验室中检测细胞增殖最准确的方法，如BrdU/EdU检测法，常应用于细胞DNA修复、分化及细胞标记物追踪等方面。

（1）BrdU法

 优点：简单、快速、安全、敏感性好；在体内和体外均可用于标记。

缺点：①BrdU是光敏型，见光易分解，掺入BrdU的细胞也容易见光淬灭因此都需要避光处理：②BrdU不稳定，即使在4℃也不稳定，尽量现配现用；③BrdU与抗体结合需要DNA的变性，并进行预处理，一般是使用DNA酶或酸处理细胞，这就破坏了DNA原有的结构。

应用场景：检测细胞增殖、细胞周期以及细胞凋亡等。

（2）EdU法

优点：①EdU只有BrdU抗体大小的1/500，在细胞内更容易扩散；②无需DNA变性（酸解、热解、酶解等）即可有效检测，可有效避免样品损伤；③操作简单，反应快速，结果准确。

缺点：较代谢活性检测和ATP水平测定方法来说，步骤较多，不适合高通量筛选。

应用场景：直观检测细胞增殖情况，单细胞水平检测细胞分裂增殖情况，还可应用于细胞DNA修复、分化及细胞标记物追踪等方面。

（3）3H-TdR渗入法

优点：敏感性高、客观性强、重复性好，具有良好的示踪作用，是一种快速、简便的方法。

缺点：设备较贵（液体闪烁计数器），同时还存在放射性核素污染问题。

应用场景：用于检测细胞DNA的代谢及细胞增殖情况。

ATP 含量检测（Cell-Titer Lumi™）

ATP 是细胞能量的基本来源，在细胞多种生理过程中发挥重要作用，是细胞新陈代谢的一个重要指标。当细胞死亡时，ATP 会迅速水解。因此 ATP 含量与活细胞数目之间具有良好的线性关系。

借助 ATP 依赖的萤光素酶催化的萤光素发光反应，ATP 可以通过测定化学发光强度来进行定量。由于 ATP 含量能很好地反映活细胞的数目，而 ATP 含量和化学发光强度成正比，这样就可以简单地通过化学发光强度来计算出细胞活力或细胞数目。

依据此原理，碧云天推出 CellTiter-Lumi™系列发光法细胞活力检测试剂盒产品，该系列产品能够通过化学发光法测定细胞内 ATP 含量，从而用于超高灵敏度、超高信号稳定性、超宽线性范围定量检测活细胞数目。

原理概要：通常以荧光素-荧光素酶生物发光的ATP检测法来测定细胞增殖情况。因为活细胞需要不断以ATP的形式输入自由能，所以通过检测ATP的增加水平可以反映出细胞增殖情况。

（1）CTG

优点：①简单CTG和细胞培养中的常用培养基兼容，如RPMI1640、MEM、DMEM、Ham'sF12等，不受酚红和有机溶剂的影响；②线性范围宽、发光强度高、检测灵敏度高、稳定性好；③操作简单，读数稳定，检测速度快。

缺点：价格昂贵，成本太高。

应用场景：生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。

（2）ATP生物发光法

优点：可以将细胞计数时间缩短至几分钟，十分快速、操作简便、灵敏度高。

缺点：易受到微生物数量、非微生物ATP、ATP提取剂、pH、温度、色素等诸多干扰因素的影响。

应用场景：广泛应用于体外药物筛选。

代谢活性检测

原理概要：基于细胞内琥珀酸脱氢酶活性，将无色的底物转化为有色产物，例如将四氮唑盐（如MTT、XTT、WST-1、WST-8等）还原为有色的甲瓒（Formazan），通过测定产物的量来评估细胞的活性和增殖能力。

（1）CCK-8法

优点：①CCK8试剂使用更为方便，无需洗涤细胞；②重复性更好，MTT实验生成的甲瓒不是水溶性的，需要使用DMSO等有机溶剂溶解，而CCK-8法产生的甲瓒是水溶性的，反应完成后可以直接用于检测：③CCK-8对细胞的毒性小，可以保持细胞原状态。

缺点：①CCK-8试剂价格略高；②CCK-8试剂的颜色为淡红色，与含酚红的培养基颜色接近，不注意的话容易产生漏加或多加。

应用场景：药物筛选、肿瘤药敏试验、生物活性因子的活性检测、细胞增殖测定等。

（2）MTT法

优点：价格低廉、灵敏且无放射性。

缺点：①MTT溶液需4℃避光保存，现用现配；②反应产生的甲瓒结晶不溶于水，无法直接测定吸光度，需要被DMSO溶解之后才能检测；③MTT通常适用于贴壁细胞的检测，不适合悬浮细胞的检测；④对细胞毒性高，反应后细胞形态会完全消失。

应用场景：药物筛选、肿瘤药敏试验、生物活性因子的活性检测、细胞增殖测定等。

（3）XTT法

优点：使用方便，省去了洗涤细胞；检测快速；灵敏度高，甚至可以测定较低细胞密度；重复性优于MTT

缺点：XTT水溶液不稳定，需要低温保存或现配现用。

应用场景：药物筛选、肿瘤药敏试验、生物活性因子的活性检测、细胞增殖测定等。

 （3）WST-1法

优点：①操作简便，且具有较高的敏感性和特异性，能够快速准确地测量细胞增殖；②由于其持久性，可以应用于细胞增殖动力学的跟踪；③适用于高通量筛选系统中的高效药物筛选。

缺点：暂无

应用场景：药物筛选、肿瘤药敏试验、生物活性因子的活性检测、细胞增殖测定等。

细胞膜通透性测定（台盼蓝、中性红）

活细胞具有完整的细胞膜结构，因此对于某些特定染料如台盼蓝、伊红等具有一定的排斥能力，而死细胞由于细胞膜破损，则可以被这些染料着色，因此可在染色后，通过显微镜观察计数，确定细胞存活数量。

此外，中性红作为一种 pH 指示剂，也常被用于细胞活性检测。活细胞对中性红具有一定的摄入能力，在生理 pH 条件下，中性红染料能够通过非离子被动扩散的方式穿透细胞膜，并且在溶酶体中积累。当细胞受到损伤时，对中性红的摄入能力就会下降。因此可以通过测定一段时间内细胞对中性红的摄入量，确定细胞的增殖或毒性情况。

原理概要：通过计算染料摄取比例，可以出反应细胞的增殖或毒性情况。根据活/死细胞膜完整性的不同，以及进入细胞内染料情况的不同，检测细胞活率。

（1）Calcein AM/PI法

优点：①操作简便，方法可靠；②可直接进行单细胞观察，较为直观；③可以用荧光酶标仪或流式细胞仪进行定量，得到活/死细胞比率；③与其它同类试剂（如BCECF-AM和Carboxy-fluorescein diacetate）相比，Calcein-AM的细胞毒性很低，更适合于活细胞的检测。

缺点：只反映活/死细胞情况，不能体现增殖代谢水平，不适合高通量筛选。

应用场景：计算细胞活率，进行活细胞和死细胞水平的分析，也可用于一些生物相容性评价。

（2）LDH法

优点：染料水溶性好、细胞毒性弱、操作简单、检测时间短等优点，适合快速、高通量检测。

缺点：血清浓度高时会有干扰，灵敏度比放射性同位素51Cr低。

应用场景：常用于测定死亡细胞和受损细胞的数量。

（3）台盼蓝染色法

优点：方便实用、价格低廉、操作简单。

缺点：①对细胞有毒害作用，会致死有损伤的细胞，导致细胞活性检测结果有所偏差；②细胞碎片多、杂质多等情况下，无法进行准确计数。

应用场景：常用于检测细胞膜的完整性，检测细胞是否存活。