细胞划痕实验（探索细胞迁移/侵袭/划痕的新方法）

      细胞运动性的研究，尤其是在肿瘤细胞的侵袭转移中应用很广泛。肿瘤转移是恶性肿瘤生物学特征之一，在肿瘤转移过程中的某些阶段，肿瘤细胞表现出较强的运动能力，如肿瘤细胞从原发瘤灶分离，进而侵入到邻近组织及再穿过血管壁进入血液循环和穿出血管壁进入继发部位等，因而细胞运动性的研究在弄清肿瘤细胞侵袭和转移的机制上有重要位置。

肿瘤细胞划痕实验（Tumor Cell Scratch Assay）是一种常用于研究肿瘤细胞迁移和侵袭能力的实验方法。该实验通过使用细胞划痕器在细胞培养皿中划出一个直线性创伤，观察并测量肿瘤细胞在创伤处的迁移和填充速度，从而评估细胞的迁移和侵袭能力。

细胞划痕实验

　　1. 细胞培养准备：选取适宜的细胞株进行培养。常用的肿瘤细胞株有HeLa、A549、MCF-7等。将细胞接种在培养皿中，培养至细胞密度达到80%以上。

　　2. 细胞划痕：用一个细胞划痕器（也可以使用200μL移液器尖端）在培养皿中划出一个直线性创伤。将划痕的位置标记，并用显微镜进行记录。

　　3. 洗涤细胞：用无血清的培养基洗涤细胞，去除游离的细胞和细胞碎片，保留划痕处的细胞。

　　4. 细胞培养：加入含有适宜浓度的培养基，继续培养细胞。观察并记录细胞在划痕处的迁移和填充情况。

　　5. 观察和测量：使用显微镜观察细胞的迁移和填充情况。可以在不同时间点拍摄照片，以便后续分析和比较。

　　肿瘤细胞划痕实验基于肿瘤细胞的迁移能力。当划痕创伤形成后，细胞会开始从划痕的两侧向中间迁移，填充创伤区域。细胞的迁移速度和填充程度可以反映细胞的迁移和侵袭能力。

　　该实验主要用于研究肿瘤细胞迁移和侵袭相关的信号通路、调控因子以及药物对肿瘤细胞迁移的影响等。通过比较不同细胞株或处理条件下细胞的迁移速度和填充程度，可以评估不同因素对细胞迁移的影响。

　　细胞划痕（修复）法是简捷测定细胞迁移运动与修复能力的方法，类似体外伤口愈合模型，在体外培养皿或平板培养的单层贴壁细胞上，用微量枪头或其它硬物在细胞生长的中央区域划线，去除中央部分的细胞，然后  继续培养细胞至实验设定的时间（例如  72h  ），取出细胞培养板，观察周边细胞是否生长（修复）至中央划痕区，以此判断细胞的生长迁移能力，实验通常需设定正常对照组和实验组，实验组是加了某种处理因素或药物、外源性基因等的组别，通过不同分组之间的细胞对于划痕区的修复能力，可以判断各组细胞的迁移与修复能力。

特点：

      细胞划痕实验是一种简单易行的检测细胞运动的方法，实验成本低，可以用来检测贴壁生长肿瘤细胞的侵袭转移能力。与  transwell  相比，细胞划痕实验具有经济、操作方便等优势。

　　肿瘤细胞划痕实验还可以与其他实验方法结合使用，如细胞侵袭实验、细胞迁移实验和转移实验等，从不同角度全面评估肿瘤细胞的迁移和侵袭能力。

　　肿瘤细胞划痕实验是一种常用的研究肿瘤细胞迁移和侵袭能力的实验方法。通过划出一个直线性创伤，观察细胞的迁移和填充情况，可以评估细胞的迁移和侵袭能力。该实验简单、快速、直观，广泛应用于肿瘤细胞迁移和侵袭研究领域，为肿瘤治疗和药物筛选提供重要参考依据。

      细胞侵袭与细胞迁移比较类似，但是“侵袭”需要细胞穿过胞外基质层（ECM）或基底膜基质层（BME），在这个过程中细胞先酶解去除ECM/BME的阻碍，从而在趋化因子浓度梯度的驱使下完成从一处到另一处的移动。常用来评估肿瘤细胞在正常组织中转移的能力，但正常细胞，如巨噬细胞也有相同的能力。

细胞迁移与侵袭实验

       将  Transwell  小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

   材料准备：

        可拍照显微镜，  Transwell  小室，孔径  8μm  ，没包被胶的  (Coster  和  Corning  公司的也较常用  )  ，  Transwell  迁移实验的细胞培养板  24  孔板。细胞培养板应当与购买的  Transwell  小室相配套，  BD  公司的  Matrigel  ，无血清  DMEM  ，  (1%  胎牛血清  )DMEM  和  1640  培养基，  DMEM  完全培养基，  1640  完全培养基（也可加到  20%  血清），无菌  PBS  ，棉签，胰酶，  4%  多聚甲醛固定液或者甲醇，结晶紫染液（  0.1%  （  g/ml  ）  PBS  结晶紫）

实验步骤：

  (1)  基质胶铺板：

用  BD  公司的  Matrigel 1  ：  8  （根据细胞产生  mmp  的量来决定）稀释，包被  Transwell  小室底部膜的上室面，置  37℃30min  使  Matrigel  聚合成凝胶。使用前进行基底膜水化。

 (2)  制备细胞悬液

   ①  制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿  12  －  24h  ，进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。

   ②  消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，（用  PBS  洗  1  －  2  遍），用含  BSA  的无血清培养基重悬。调整细胞密度至  5×105/ml  。

  (3)  接种细胞

   ①  取细胞悬液  100undefinedmicro;l  加入  Transwell  小室。

   ② 24  孔板下室一般加入  600undefinedmicro;l  含  20%PBS  的培养基，特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。

   ③  培养细胞：常规培养  12  －  48h  （主要依癌细胞侵袭能力而定）。  24h  较常见，时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。

 (4)  结果统计

        直接计数法，  “  贴壁  ”  细胞计数，这里所谓的  “  贴壁  ”  是指细胞穿过膜后，可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去，通过给细胞染色，可在镜下计数细胞。

       取出  Transwell  小室，弃去孔中培养液，用无钙的  PBS  洗  2  遍，甲醇固定  30  分钟，将小室适当风干。

0.1%  结晶紫染色  20 min  ，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，用  PBS  洗  3  遍。  400  倍显微镜下随即五个视野观察细胞，记数。

注意事项：

       一般做划痕实验，都是在无血清或者底血清状态下培养的，否则细胞增殖就不能忽略。按照  6  孔板背后画线的垂直方向划痕，可以形成若干交叉点，作为固定的检测点，这就解决了前后观察时位置不固定的问题。