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细胞培养虽是实验人的入门手艺，却也不能掉以轻心！一不小心来个污染...（细胞的污染是必然事件，而不污染是随机事件。）然而，对于养细胞的人来说，真的是不想看到细胞的污染。细胞的污染将直接导致实验材料的不纯净，造成数据的错误，及后续实验结果的不可靠。因此，细胞的污染一旦出现，往往代表着实验按下暂停键，又要重复进行前面的细胞获取和培养实验，很可能几个月的埋头苦干就此白费。
细胞污染是指在细胞培养过程中，外源性污染物进入细胞环境并对细胞生长和功能产生负面影响的现象。常见的细胞污染有细菌污染、支原污染、黑胶污染、真菌污染、病毒污染以及交叉污等污染。准确识别细胞污染的表现对于细胞研究和生物技术应用至关重要。每一种污染都有各自的特点。如细菌和霉菌增殖迅速，短时间就对细胞造成明显伤害；而支原体和病毒对细胞的影响则是一种缓慢长期的过程。本文将详细介绍细胞污染的表现，并提供相应的解决方案。
1. 细胞形态改变
当细胞受到污染物的侵袭时，其形态可能会发生明显改变。例如，细胞形状变得不规则，细胞边缘出现突起或伸展，并出现细胞膜破损的现象。这些形态改变可导致细胞的功能异常和细胞凋亡。
2. 细胞生长受阻
受到污染物的影响，细胞的生长速度明显减慢或停止。细胞数量在培养过程中无法达到预期的增长水平，或呈现持续下降的趋势。这可能是由于污染物对细胞的代谢、分裂或增殖等关键生物过程产生干扰所致。
3. 细胞功能异常
细胞污染还会导致细胞功能异常。这些异常可能包括细胞信号传导、基因表达、蛋白质合成和酶活性等方面的改变。细胞的正常生理活动受到抑制，从而影响了细胞的正常功能和代谢活动。
4. 免疫细胞反应
当细胞受到污染物的刺激时，免疫细胞可能会被激活，产生炎症反应。这种免疫细胞反应可能导致细胞的损伤和死亡，进一步加剧细胞污染的影响。
5. 细胞死亡
细胞污染可能导致细胞凋亡或坏死。细胞凋亡是一种程序性细胞死亡方式，通常与细胞受到外界刺激或内部异常信号有关。细胞坏死则是一种非程序性细胞死亡方式，通常与严重的细胞损伤或炎症反应有关。
6.细胞支原体污染
主要特征：①培养液一般培养液一般会浑浊；②黑色的，在镜下无法看到；③支原体感细胞以后，细胞病变不很明显，只是慢慢死去。
支原体是一种自然界中能独立生活的最小微生物，能通过细菌滤，在细胞培养过程中，支原体感染发生率很高。支原体是牛血清中最常见的微生物之一。
7.细胞黑胶虫污染：
主要特征：①低倍镜下观察时可见黑色小点，高倍镜下可看见黑色的小虫游来游去；②培养液不浑浊。
对细胞生长状态不会有明显影响，在细胞增殖旺盛之后会自然消失，除更换血清外无须特殊处理。
8.细胞病毒污染：
组织细胞培养过程中，如果没有除去潜在的病毒，就会产生病毒污染。尽管病毒污染的细胞不影响原代培，但生产疫苗是不安全的。
9.细胞细菌污染：
主要特征：①低倍镜下观察不到正常细胞形态，黑色沙粒状布满细胞间隙或培养基，高倍镜下可见杆状或球状的细菌在培养基中游动；②培养液一般会浑浊变黄，稍微振荡后可见培养基表面有漂浮物。需注意的是，在污染初期，细菌常成群存在，不一定会有明显的运动，此时需引起警惕。
10.细胞交叉污染：
由于细胞培养操作时，各细胞株所需的器具和试剂没有严格分开，往往会使一种细胞被另一种细胞污染。目前，世界上已有几十种细胞都被HeLa细胞所污染，致使许多实验宣告无效。
细胞污染解决方案：
1. 培养环境净化
细胞培养过程中，严格控制培养环境的洁净度至关重要。使用无菌技术和洁净设备，避免污染物进入培养环境。
2. 污染物检测与筛查
及时检测和筛查污染物对细胞的影响，采取相应的措施。常用的检测方法包括聚合酶链反应（PCR）、细菌培养和染色等。
3. 选择合适的细胞培养基和添加剂
细胞培养基和添加剂的选择对于细胞的健康和生长至关重要。应根据具体细胞类型和研究需求选择适当的培养基和添加剂。
4. 定期检查和保养培养设备
定期检查和保养培养设备，确保其正常运行和细胞培养的稳定性。定期更换培养器具和培养基，避免细胞污染的产生和传播。
5. 细胞处理和处理废物的规范操作
6.①支原体清除(MRA)是解决细胞培养中支原体污染严重问题的有效方法。②清洗纯化法：其原理是利用离心力、细胞、微生物质量和悬液的浮力差达到清除支原体的目的。由于支原体个体小且除发酵支原外多为细胞外寄生,所以通过反复洗涤细胞和低速离换液使其中潜在的支原体数量降低至极限。③药物处理，如敏感抗生素的抑杀作用。④使用支原体特异性血清：用5%的兔支原体免疫血清可去除支原体污染
7.黑胶虫污染主要源于血清，故实验时尽量采用质量和口碑较好的血清培养。建议如果细胞有可能是此种污染的话，可以更换血清，增加细胞密度，提高细胞的生长率。
8.针对病毒和交叉污染较难清除，建议丢弃细胞重新培养
在细胞处理和处理废物时，应采取规范操作和相应的防护措施，避免污染物进入细胞培养环境。上述污染去除方案均是在细胞极其珍贵情况下的无奈之举，在细胞易于获得的情况下还是建议伙伴们直接处理掉污染的细胞，重新以新批次细胞进行试验，不仅节约时间，而且风险更小。
细胞污染前的预防措施
微生物污染在细胞培养中是非常常见的，也是令人头大的一件事情。而预防是防止细胞培养过程中发生污染的最好办法。只有预防工作做在前，才能将发生污染的可能性降到最小程度。
根据统计培养细胞产生的污染源，常常来自于不洁的环境和不规范的实验操作，比如受污染的培养基、试剂或仪器。因此，一般预防可从以下几方面着手：
（1）在培养液中添加抗生素。
可以在培养基中事先加入双抗（硫酸链霉素和氨苄青霉素）。但双抗有时会影响细胞的状态，所以在做转染、检测细胞某项指标前一定要撤去双抗，以避免影响实验结果。
（2）从消毒灭菌着手
①细胞培养所用物品清洗、消毒要彻底，各种溶液灭菌除菌要仔细，并在无菌试验阴性后才能使用。
玻璃吸管和玻璃培养瓶的消毒：1)高压蒸汽灭菌15分钟以上；2)干烤消毒140℃ 2小时以上。
培养基(pH7.2)和血清配制好后要做无菌试验：将血清按10%加入培养基内，用无菌的玻璃离心管或玻璃瓶取完全培养基5-10ml置培养箱内培养2-3天，肉眼见无浑浊或沉淀等异物。分装后置4℃保存。
消化液(pH7.8)或其它加入液，应用高压蒸汽灭菌或一次性无菌滤器过滤除菌，分装成置-20℃保存。
②操作室及剩余的无菌器材要定期清洁消毒灭菌。
定期清洗或更换超净台过滤膜、预滤网。
CO2培养箱的清洁是较易被忽视的地方，应1-2个月对培养箱定期进行清洁消毒。先用75%酒精擦拭培养箱内壁、隔板、水盘2-3次，用双蒸水清洗，再用酒精棉球擦拭一遍，最后紫外灯照射1h以上或进行高温高压灭菌处理。水盘内加入无菌水（应每周更换），待培养箱内温度、湿度、CO2浓度稳定后再放入细胞。
在细胞间内准备专用的仪器如离心机，移液器，水浴锅等，并定期进行消毒，减少细胞污染的可能性。
③实验环境的彻底消毒
甲醛熏蒸法：甲醛是一种广谱灭菌剂，其水溶液和气体对各种细菌、芽孢及真菌等微生物均有杀灭作用。
实验环境紫外照射 15~30 min 灭菌
（3）规划实验操作
虽然，养细胞的步骤很简单无非是换液、传代、冻存、复苏。但是具体有好多小细节需要注意....
进入实验室环境时，佩戴好口罩及手套，穿上洁净实验服，避免灰尘或唾液进入培养物中。
超净台用紫外灯照射30-60min，并开启超净台风机运转5-10min，然后用75%酒精球擦拭超净台台面，再开始实验操作。
进入超净台前应用75%酒精对双手及手腕进行全面擦拭，确保除菌完全。
实验用品用75%酒精擦拭后才能放入超净台内。生物安全柜和超净工作台里的东西能少尽少。东西过多会干扰气流，反而更不安全，并且在物品的摆放要有一定的顺序分区要规划好。这样细胞在生物安全柜或者超净台才能安全。
操作动作要轻，必须在火焰周围无菌区内打开瓶口，并将瓶口转动烧灼。操作时尽量不要说话，若打喷嚏或咳嗽应转向背面。
操作时小心取用无菌物品，应避免污染。勿碰触吸管尖头，不小心碰触后应立即更换；手及物品不要在暴露的瓶口上方来往，容器打开后，倾斜45度操作，操作完成后及时盖上瓶盖。
操作时要常更换吸管，一旦发现吸管口接触了手和其他污染物品应弃去。实验完毕用消毒水浸泡的纱布擦台面。
实验用品用完应移出超净台，以利于空气流通。
实验完成后用75%酒精擦拭超净台台面。
（4）防止细胞交叉污染
在进行多种细胞培养操作时，所用器具要严格区分，即使不同细胞使用相同的培养基也不要共享同一瓶培养基，避免细胞间的交叉污染。
每次操作最好只处理一种细胞，多种细胞多种操作一起进行时易发生不同细胞间的污染；
在进行换液或传代操作时，注射器和滴管不要触及细胞培养瓶瓶口，以免把细胞带到培养液中污染其他细胞。
（5）所有新购入或接入的细胞，必须及时保种冻存，一旦发生污染可重新复苏细胞，继续培养，这是抵御污染最直接有效的办法。
