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细胞复苏原理
细胞复苏是指将冻存在液氮或者-70℃冰箱中的细胞解冻之后重新培养，细胞恢复生长的过程。当恢复到常温状态时，细胞的形态结构保持正常，生化反即刻恢复。细胞复苏过程升温要快，原则是慢冻快融，防止在解冻过程中水分进入细胞，形成冰晶，影响细胞存活。
快速融化：细胞复苏过程升温要快，防止在解冻过程中水分进入细胞，形成冰晶，影响细胞存活。
在复苏时，需要快速升温，在 1-2 min 内融化并稀释，这时细胞内外还来不及形成较大的冰晶，也不会使细胞长时间暴露在高浓度的电解质溶液中，从而避免细胞损伤，提高细胞存活率。
避免温度变化：在复苏过程中，应尽量避免温度的剧烈变化，以免对细胞造成额外的压力。
（1）提前从液氮罐中取出需要解冻的冻存管，放于-80 ℃冰箱（为了避免解冻时冻存管中的气温急剧上升，温差过大导致的爆炸），让冻存管中的液氮挥发。
（2）冻存管取出后，以最快速度放入37℃恒温水浴锅中。如果储存装置和解冻装置相隔较远，可使用装有干冰的隔热容器临时保存和运送细胞。
细胞放入水浴中复苏时，注意用镊子夹住细胞冻存管并在水浴中不时晃动，使其受热均匀，且速度越快越好，这样可以可以避免复苏过程中细胞液中有冰晶的出现。快速升温可以使冰晶迅速融化，避免伤害细胞，因此，必须在1-2min内使冻存液完全融化。
另外，冻存管管口不能接触到水浴锅里的液体，避免造成污染。水浴锅中的无菌水也要定期更换。
什么时候停止解冻？
（3）完全融化后，马上擦干并用75％酒精擦拭冷冻管外部进行消毒。然后在无菌环境下，用移液管吸取5ml预热的完全培养基加入15mL无菌离心管中，再吸取冻存管里的细胞悬液加入离心管中。
注意：
◆ 解冻后应尽快稀释，以减少 DMSO 的细胞毒性。
（4）根据细胞类型选择合适的离心速度，低速离心5min，吸掉上清液，加入2-3mL预热的完全培养基，用移液管轻轻吹打均匀，保证细胞完全重悬。
（5）吹打好后，用完全培养基适当稀释，然后将重悬的细胞全部移入新的培养皿或者培养瓶中摇晃均匀。
（6）最后放入37℃恒温细胞培养箱，依据细胞状态，在细胞贴壁后或 24 h 后，更换一次培养液，继续培养，观察生长情况。若细胞密度较高，及时传代。
注意：细胞复苏的操作在4℃冰盒中进行，以减少冷冻保护剂对细胞的毒性。
细胞复苏试验常见问题
（1）细胞复苏后，细胞数量很少
可能得原因：细胞冻存前活细胞少，状态不佳；细胞解冻速度过慢；细胞冻存悬液在常温下时间太久；未充分稀释冻存液；离心速度不恰当。
对策：
◆ 确保冻存前细胞状态良好，活细胞比例高。
◆ 加快解冻速度，尽量减少在常温下的放置时间。
◆ 确保冻存液充分稀释，避免对细胞造成损伤。
（2）细胞复苏后，很多难以贴壁
对策：
◆ 检查缓冻快融操作是否规范，避免操作不当导致的损伤。
◆ 确认冻存前细胞的密度和活率是否适宜。
（3）细胞贴壁了，却长不起来
对策：
◆ 调整细胞密度，尝试将细胞转移到较小的培养器皿中，促进细胞间的相互作用。
◆ 给予细胞足够的时间来适应培养环境，有些细胞复苏后需要一段时间才能开始生长。
此外，还需注意培养环境的无菌操作，定期检查培养基的成分和pH值，以及确保足够的营养供给和适宜的气体环境（如CO2浓度）。在处理细胞时，温和操作，避免造成机械损伤。
细胞培养是一门实践性很强的技术，需要在实践中不断学习和总结经验，希望这些建议对您有所帮助。
（以上仅供参考）
