细胞凋亡实验步骤（细胞凋亡实验原理）

        细胞死亡根据其性质、起源及生物学意义区分为凋亡和坏死两种不同类型。凋亡普遍存在于生命界，在生物个体和生存中起着非常重要的作用。它是细胞在一定生理条件下一系列顺序发生事件的组合，是细胞遵循一定规律自己结束生命的自主控制过程。细胞凋亡具有可鉴别的形态学和生物化学特征。

在形态上可见凋亡细胞与周围细胞脱离接触，细胞变园，细胞膜向内皱缩、胞浆浓缩、内质网扩张、细胞核固缩破裂呈团块状或新月状分布、内质网和细胞膜进一步融合将细胞分成多个完整包裹的凋亡小体，凋亡小体最后被吞噬细胞吞噬消化。在凋亡过程中细胞内容物并不释放到细胞外，不会影响其它细胞，因而不引起炎症反应。

在生物化学上，多数细胞凋亡的过程中，内源性核酸内切酶活化，活性增加。核DNA随机地在核小体的连接部位被酶切断，降解为180-200bp或它的整倍数的各种片断。如果对核DNA进行琼脂糖电泳，可显示以180-200bp为基数的DNA ladder（梯状带纹）的特征。

相比之下，坏死是细胞处于剧烈损伤条件下发生的细胞死亡。细胞在坏死早期即丧失质膜完整性，各种细胞器膨胀，进而质膜崩解释放出其中的内容物，引起炎症反应，坏死过程中细胞核DNA虽也降解，但由于存在各种长度不等的DNA片断，不能形成梯状带纹，而呈弥散状。

一些温和的损伤刺激及一些抗肿瘤药物可诱导细胞凋亡，通常这些因素在诱导凋亡的同时，也可产生细胞坏死，这取决于损伤的剧烈程度和细胞本身对刺激的敏感程度。

 1. 什么是细胞凋亡？

　　细胞凋亡是一种规范的、有序的细胞死亡过程。它是维持机体内细胞数量平衡和组织结构完整的重要方式。相比于坏死，细胞凋亡具有以下特点：细胞体积缩小、细胞核染色质凝聚、细胞核DNA断裂、产生“梳状”的DNA片段等。

　　2. 为什么需要诱导细胞凋亡？

　　诱导细胞凋亡可以用于多方面的研究和应用。在细胞生物学研究中，诱导细胞凋亡可以用于探究细胞凋亡的机制、调控因子以及细胞信号通路。在疾病治疗方面，诱导细胞凋亡可以被用于治疗肿瘤、心血管疾病、神经退行性疾病等。在药物研发方面，诱导细胞凋亡可以用于筛选和评估药物的抗肿瘤活性。

　　3. 如何诱导细胞凋亡？

　　诱导细胞凋亡的方法有很多种。常用的方法包括化学药物诱导、放射线诱导、细胞因子诱导、基因工程等。其中，化学药物诱导是最常用的方法之一。一些化学药物，如紫杉醇、阿霉素、顺铂等，可以通过作用于细胞的DNA、蛋白质或细胞膜等组分，进而激活细胞凋亡信号通路，诱导细胞凋亡。

　　4. 如何判断细胞是否进入凋亡状态？

　　判断细胞是否进入凋亡状态常用的方法包括细胞形态观察、DNA断裂检测、细胞凋亡相关蛋白的表达检测等。在形态学上，凋亡细胞的特点是细胞体积缩小、细胞核染色质凝聚。DNA断裂检测可以通过凝胶电泳等方法检测细胞核DNA断裂产生的“梳状”片段。细胞凋亡相关蛋白的表达检测可以用免疫荧光染色、Western blot等方法来进行。

　　5. 诱导细胞凋亡有哪些应用？

　　诱导细胞凋亡在研究和应用中有广泛的应用。在细胞生物学研究中，诱导细胞凋亡可以用于探究细胞凋亡的调控机制、信号通路以及相关蛋白的功能。在疾病治疗方面，诱导细胞凋亡可以用于治疗肿瘤、心血管疾病、神经退行性疾病等。在药物研发方面，诱导细胞凋亡可以被用于筛选和评估抗肿瘤活性的药物。

一、实验目的

1、掌屋凋亡细胞的形态特征

2、学会用荧光探针对细胞进行双标记来检测正常活细胞、凋亡细胞和坏死细胞的方法

二、实验原理

细胞死亡根据其性质、起源及生物学意义区分为凋亡和坏死两种不同类型。凋亡普遍存在于生命界，在生物个体和生存中起着非常重要的作用。它是细胞在一定生理条件下一系列顺序发生事件的组合，是细胞遵循一定规律自己结束生命的自主控制过程。细胞凋亡具有可鉴别的形态学和生物化学特征。

在形态上可见凋亡细胞与周围细胞脱离接触，细胞变园，细胞膜向内皱缩、胞浆浓缩、内质网扩张、细胞核固缩破裂呈团块状或新月状分布、内质网和细胞膜进一步融合将细胞分成多个完整包裹的凋亡小体，凋亡小体最后被吞噬细胞吞噬消化。在凋亡过程中细胞内容物并不释放到细胞外，不会影响其它细胞，因而不引起炎症反应。

在生物化学上，多数细胞凋亡的过程中，内源性核酸内切酶活化，活性增加。核DNA随机地在核小体的连接部位被酶切断，降解为180-200bp或它的整倍数的各种片断。如果对核DNA进行琼脂糖电泳，可显示以180-200bp为基数的DNA ladder（梯状带纹）的特征。

相比之下，坏死是细胞处于剧烈损伤条件下发生的细胞死亡。细胞在坏死早期即丧失质膜完整性，各种细胞器膨胀，进而质膜崩解释放出其中的内容物，引起炎症反应，坏死过程中细胞核DNA虽也降解，但由于存在各种长度不等的DNA片断，不能形成梯状带纹，而呈弥散状。

一些温和的损伤刺激及一些抗肿瘤药物可诱导细胞凋亡，通常这些因素在诱导凋亡的同时，也可产生细胞坏死，这取决于损伤的剧烈程度和细胞本身对刺激的敏感程度。

三尖杉酯碱（HT）是我国自行研制的一种对急性粒细胞白血病，急性单核白血病等有良好疗效的抗肿瘤药物。研究表明HT在0.02~5μg/ml范围内作用2小时，即可诱导HL-60细胞凋亡，并表现出典型的凋亡特征。本实验用1μg/ml HT在体外诱导培养的HL-60细胞发生凋亡，同时也有少数细胞发生坏死。用Hoechst33342和碘化丙啶（propidium iodide，PI）对细胞进行双重染色，可以区别凋亡、坏死及正常细胞。

细胞膜是一选择性的生物膜，一般的生物染料如PI等不能穿过质膜。当细胞坏死时，质膜不完整，PI就进入细胞内部，它可嵌入到DNA或RNA中，使坏死细胞着色，凋亡细胞和活细胞不着色。而一些活细胞染料由于为亲脂性物质，可跨膜进入活细胞，因而可进行活细胞染色。Hoechst33342是一种活性荧光染料且毒性较弱，它是双苯并咪唑的一种衍生物。与DNA特异结合（主要结合于A-T）碱基区），显示凋亡细胞和活细胞。凡是看到有凋亡小体的细胞都是凋亡细胞。

三、实验用品

1、试剂：三尖杉酯碱（HT），300μg/ml，100mmol/L Tris-HCl（pH7.5），5mol/L EDTA缓冲液、碱性裂解液：0.2mol/L NaOH, 1%SDS、醋酸钠：3mol/L KAc（pH4.8）；异丙醇；70%乙醇；溴酚蓝，蔗糖指示剂。TBE电泳缓冲液，1%琼脂糖，溴乙锭。PI母液：500μg/ml；Ho33342母液：2mmol/L。

2、仪器设备：荧光显微镜，电泳仪，电泳槽，微量加样器（1ml，100μl）0.5、1.5ml离心管，载玻片，盖玻片。

四、实验材料

人早幼粒白血病HL-60细胞，用含10%小牛血清的RPMI1640培养基在37℃，5%CO2条件下培养。

五、方法步骤

1、三尖杉酯碱诱发HL-60细胞凋亡

（1）实验前约24小时，接种两瓶HL-60细胞，标记①、②，每瓶含约6ml培养液，置37℃，5%CO2培养箱培养。

（2）实验前约2.5小时，当细胞密度达到70%，①号瓶加入三尖杉酯碱200μl，使终浓度为1μg/ml，②号瓶中加入同等量PBS（pH7.4）作对照。共同放入培养箱中继续培养2.5小时。

2、Ho33342和PI双重染色鉴别三种细胞

（1）染色：将瓶中的细胞摇匀取200μl于1.5ml的离心管中，加入Ho33342母液2μl，PI 20μl，染色15分钟。

（2）滴片：取一载玻片用双面胶围成一小室，从离心管中各取以上染色后的细胞悬液10μl，加入小室内盖上盖玻片，荧光镜下用紫外激发光，高倍镜下观察，区别三种细胞，并注意三者比例。

注意事项：

1. 诱导培养HL-60细胞时间要准确；

2. 荧光显微镜下观察细胞时，由于荧光易碎灭，观察时要尽量快。