细胞培养开始前的准备工作和器具有哪些 ？ （新手入门必看）

细胞培养的准备工作是很重要，也很复杂的一项工作，应予以重视。

一、掌握相关知识：

1.学习细胞培养知识。了解相关概念、方法，记住操作过程，观摩、参与实际操作。参考书《动物细胞培养-基本技术指南》（科学出版社）。

2.掌握无菌技术。高压消毒实验用品：操作台上不是一次性的物品均需做灭菌处理，无法高压的物品应使用75%酒精消毒。消毒操作间和操作台：使用75%酒精擦拭无菌间的墙面、地面，操作台的台面，孵箱，离心机等。操作前须用紫外线照射无菌间和操作台30分钟消毒。入无菌间须穿隔离服，戴手套、口罩、帽子。用75%酒精洗去手套上的滑石粉。无菌操作：操作时应尽量接近酒精灯；拿取吸管时，避免接触其使用端；不要在开口器皿的上方操作；吸取不同液体应更换吸管。不能碰瓶口。万一碰到，更换吸管。

二、细胞培养用品的准备：

细胞培养的准备工作是很重要，也很复杂的一项工作，应予以重视。

 1无菌服装：包括消毒隔离服（有条件的实验室）或专用工作服（如白大褂）、无菌手套、无菌帽和口罩。除隔离服外，其他物品最好为一次性使用。

 2.无菌室及无菌操作台：有条件的实验室可装备超净培养间，超净工作台和生物安全柜也可。所有物品除一次性物品外均需高压灭菌。有酒精灯及95%酒精、吸管或枪（枪头）、洗耳球、或电动移液器、小试管及试管架、培养瓶架、离心管、培养皿或培养瓶、计数板、废液缸。无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以70% ethanol擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在台面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminar flow) 以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以70% ethanol擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。

3.仪器设备：相差显微镜、离心机、冰箱、水浴锅、无菌车及架子、废物桶、marker笔、灭菌擦手纸、75%酒精喷壶。玻璃器皿的清洗、干燥、消毒：

1）细胞培养的和主要是玻璃容器与pasteur pipet，其它均为塑料无菌制品。

2）实验用的玻璃容器与pasteur pipet使用前都要进行清洗。新购玻璃血清瓶先以0.1~0.05 N HCl 浸泡数小时，洗净后才开始使用。

3）用过之玻璃血清瓶，以高压蒸汽灭菌，洗净后分别用一次与二次去离子水冲洗干净，勿加清洁剂清洗。

4）实验用玻璃血清瓶以铝箔纸包覆瓶盖，高压蒸汽灭菌121℃, 15 lb, 20 分钟，置于oven中烘干。实验用玻璃pasteur pipet以干热灭菌170℃, 4 小时。

培养容器：种类有Tflask，plates, dishes, roller bottle等，依实验需要使用。

4.培养用液：PBS或D-hanks、胰酶等消化液（一般为0.05%或0.25%）、培养基（常用的有DMEM、R1640、MEN-EBSS、MEN-NEAA、F12、L15等）、血清（胎牛、小牛、马等）、生长因子、药物。培养用液需提前向公司订购，或咨询联系电话（010-51291224）。这些培养用液都有商业供应，不建议购买粉剂自己制备液体。细胞培养基通常须添加10%血清，液体培养基贮存于4℃冰箱，避免光照，实验进行前放在37℃水槽中温热。液体培养基（加血清）存放期为六个月，期间glutamine可能会分解，若细胞生长不佳，可以再添加适量glutamine。

2）粉末培养基(以1升为例)之配制体积为900ml，pH为7.2-7.4。NaHCO3为另外添加，若将NaHCO3粉末直接加入液体培养基中会造成pH之误差，或

5.其他实验相关用品。一些非常规特殊用途的添加成分或实验用品，须向公司订购，因寄送有一定滞后性，建议在订细胞之前购买。