永生化人脑微血管内皮细胞培养指南（永生化人脑微血管内皮细胞实验详细步骤）

收到hCMEC/D3永生化人脑微血管内皮细胞后，请按照以下方法进行操作:

　　2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。取出25cm2培养瓶，75%酒精擦村培养瓶，拆下封口膜，放入37°，5%CO,细胞培养箱中静置3-4小时以稳定细胞状态，然后换用新鲜完全培养液继续培养或进行传代。

2、细胞传代: ①细胞生长至覆盖培养瓶的80%面积时，弃25cm培养瓶中的培养液，用PBS清洗细胞一次; ②添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml至培养瓶中，倒置显微下观察，待细胞回缩变圆后加入完全培养液终止消化，再轻轻吹打细胞使之脱落，然后将县液转移至15ml离心管中，1000rpm离心5min; ③弃上清，沉淀细胞用12m1完全培养基重悬，然后按1:2比例进行分瓶传代，*后放入37°，5%CO细胞培养箱中培养 ④待细胞完全贴壁后，观察培养结果，之后进行换液培养或传代。 3、细胞冻存: ①细胞生长至覆盖培养瓶的80%面积时，弃25cm培养瓶中的培养液，用PBS清洗细胞一次; ②添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml至培养瓶中，倒置显微下观察，待细胞回缩变圆后加入完全培养液终止消化，轻轻吹打细胞使之脱落，然后将县液转移至15ml离心管中，1000rpm离心5min; ③用适量的冻存液(FBS:DMSO=9 :1重细胞，并放置于冻存管中; ④先将细胞冻存管放置于-20C 1.5h，然后将其移入-80过夜，24h后转入液氮中进行长期保存。使用程序降温盒可直接放A-80°C 4、冻存细胞的复苏：

　　将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶（或皿）中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。 5、 ①从液氮中取出细胞冻存管(注意:佩防爆管面具，快速将其置入379水浴中解冻，直至冻存管中无结晶，然后用75%的酒精擦拭冻存管外壁; ②将冻存管中的细胞移至含5ml完全培养基的15ml离心管中， 1000rpm离心5min; ③弃上清，沉淀用5ml完全培养基重悬，接种25cm培养瓶，于37°C，5%CO细胞培养箱中培养; ④第二天，换用新鲜完全培养基继续培养。

备注：运输用的培养基（灌液培养基）不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基来培养细胞。收到细胞后第一次传代建议T25培养瓶1：2传代。